三孢布拉霉发酵番茄红素的小分子代谢及工艺研究
发布时间：2020-07-25 20:15
【摘要】：番茄红素是一种广泛存在于自然界中的萜类衍生物。其作为一种功能性色素,目前被广泛用于食品和保健品中,为人们提供抗癌、抗衰老等功效。番茄红素的市场需求目前仍处于扩张阶段,相较于同属萜类衍生物的β-胡萝卜素,其价格居高不下。天然来源的番茄红素面临着植物来源受限、产能不稳定,纯度不高等问题。而化学合成的番茄红素虽然廉价易得,但是其副产物多,尤其在合成过程中形成的杂质对下游的应用安全带来了较大风险,难以达到食品和医药领域的使用要求。随着生物发酵工业的日趋成熟,利用微生物发酵生产番茄红素已成为工业界的首选技术。现阶段,三孢布拉霉(Blakesleatrispora)是在诸多能够合成番茄红素的菌株中唯一实现工业化生产的菌种。本课题以三孢布拉霉CBOM2014378(+)和CBOM2014379(-)为出发菌株,筛选出具有工业应用前景的阻断剂,并根据所选阻断剂相应建立了三孢布拉霉的番茄红素高产突变株选育策略,还建立了一种基于低安全风险阻断剂的发酵工艺,并在高产菌株基础上对发酵工艺进行了优化,并经中试验证。主要研究结果如下:1.阻断剂的筛选基于现行的国内外食品安全法规,有针对性的筛选允许在食品工业中有残留限量的物质,最终挑选出3种有效阻断剂,分别为尼古丁、咪唑、吡啶,其特点分别为尼古丁阻断效率高,足量添加时所产番茄红素纯度最高;咪唑已在国外用于工业生产,具有相对成熟的技术使用经验和市场法规接受度,其固体形态便于生产操作;吡啶最为廉价,且是唯一一个在国内食品安全法规中在列的物质,其使用成本和应用风险相对最低,但阻断效果最差。2.不同阻断剂对三孢布拉霉小分子代谢的影响在分别添加上述三种阻断剂的情况下,通过对三孢布拉霉发酵番茄红素过程中的小分子代谢物进行分析,发现使用尼古丁作为阻断剂的安全性风险相对较低,它不在菌体内代谢出有害衍生物,而咪唑在菌体内代谢出含苯环的衍生物,吡啶在菌体内生成含氮杂环衍生物。因此最终选择尼古丁为后续实验用阻断剂。3.番茄红素高产菌株的筛选通过N+诱变(+)菌,N+诱变、平阳霉素、氯化锂复合诱变(-)菌,使用乙烯利及尼古丁为筛选剂筛选(-)菌,其中乙烯利可在尼古丁存在时释放乙烯,从而刺激八氢番茄红素合成酶的表达,增强类胡萝卜素显色程度,后以(-)菌配对筛选(+)菌,得到高产菌株:BT-LYC2017802(+)菌和BT-LYC2017403(-)菌,摇瓶验证番茄红素最高发酵水平为2.3 g/L左右,较初始菌株提高44.2%。4.番茄红素高产菌株的50 L发酵罐小试工艺在50 L发酵罐水平建立基于新菌种的发酵工艺。以尼古丁为阻断剂,重新确立了其基础培养基,补料策略,阻断剂添加方式等,并建立溶氧控制模型,最终得到最高达到2.02 g/L的番茄红素产量,较初始发酵工艺1.21 g/L,提高了67%。通过通气量控制,节约能耗10%。使得番茄红素综合成本较初始下降85%。5.番茄红素高产菌株的1000 L发酵罐中试工艺验证基于50 L小试工艺进行等比例放大,以溶氧为主要控制参数,经124 h发酵得到1.83 g/L的番茄红素产量,工艺过程验证了溶氧控制模型的有效性,并确定发酵液中无尼古丁残留风险。
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ920.6;TQ28
【图文】：
１．邋１．邋１番茄红素的理化性质逡逑番茄红素分子式为ｃ４0ｈ６（），有多种同分异构体，但在自然界中多为全反式逡逑结构，与长链多不饱和脂肪酸类似，其结构中含有多个不饱和键（图１．１）。这逡逑种含有大量双键的结构不仅决定了番茄红素的光吸收特性（紫外吸收峰Ａ邋ｍａｘ逡逑为４７２ｎｍ），还赋予它鲜艳的颜色和极强的抗氧化能力，该能力可用于碎灭单逡逑线态氧和清除体内的自由基Ｍｌ。番茄红素可溶于油脂和部分有机溶剂如脂肪逡逑烃、芳香烃、苯、氯仿等，不溶于水、甲醇、乙醇等极性较强的溶剂。其化学逡逑性质活泼，易在富氧、紫外线照射条件下迅速氧化，而全反式结构相对更稳定逡逑［５－６］，因而自然提取来源的番茄红素多为这种结构。逡逑ｃｈ３邋ｃｈ３邋ｃｈ３逦ＩＬ逡逑ｊｌ逦ＣＨ３邋ｃｈ３邋ｃｈ３逡逑ｈ３ｃ邋ｃｈ３逡逑图１．１番茄红素的全反式分子结构逡逑１．１．２番茄红素的生理功能逡逑番茄红素可通过清除自由基来保护ＤＮＡ和蛋白质，进而保证细胞内的稳逡逑态。逡逑番茄红素可以与二氧化氮、过氧化氢等活性氧碎片之间发生氧化还原反应逡逑来消除自由基，它还可以通过吸收被激发的电子能量生成三重态的番茄红素，逡逑１逡逑
表２．１流动相洗脱梯度逡逑时间（ｍｉｎ）逦Ａ相：乙腈：水＝９：１邋（ｖ／ｖ）逦Ｂ相：乙酸乙ＢＳ逡逑０逦１００逦０逡逑１５逦０逦１００逡逑２５逦０逦１００逡逑２７逦１００逦０逡逑．番茄红素标准液配制及样品前处理逡逑制番红的标准溶液浓度分别为１邋ｍｇ／Ｌ，２邋ｍｇ／Ｌ，５邋ｍｇ／Ｌ，１０ｍｇ／Ｌ，２５邋ｍｇ／ＬＬ。制作标曲及确定出峰时间为１１．１５３邋ｍｉｎ邋（图２．１）。逡逑取０．０１邋ｇ邋（精确至０．０００１邋ｇ）样品于ｌＯＯｍＬ的容量瓶中，使用乙酸乙酯度（需保证样品完全溶解）。取出ｌｍＬ溶液置于丨ＯｍＬ容量瓶中，使用定容至刻度，混匀后过０．４５邋ｐｍ滤膜过滤后待测。逡逑９００－逡逑
尤其在通气量大时，一次性添加可能造成不必要的损失和浪费，且导逡逑致后续生物量增加时需要额外加大阻断剂用量，因此可以在生物量的对数生长期逡逑中期、末期分两次添加。如图２．２所示，５０邋Ｌ发酵罐验证实验中，生物量在４０邋ｈ左逡逑右到达平台期，以此为依据，计划分别在２０邋ｈ左右，４４邋ｈ左右各添加５０邋％的阻断逡逑剂。咪唑则可以在３２邋ｈ左右一次性添加。逡逑５０逡逑４５邋■逦—ＤＣＷ逦１逡逑４０邋■逦＾ｉＪ＋Ｉ逡逑３５逦ｙｒ＼逡逑ｇ邋：逦计划尼
本文编号：2770311
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ920.6;TQ28
【图文】：
１．邋１．邋１番茄红素的理化性质逡逑番茄红素分子式为ｃ４0ｈ６（），有多种同分异构体，但在自然界中多为全反式逡逑结构，与长链多不饱和脂肪酸类似，其结构中含有多个不饱和键（图１．１）。这逡逑种含有大量双键的结构不仅决定了番茄红素的光吸收特性（紫外吸收峰Ａ邋ｍａｘ逡逑为４７２ｎｍ），还赋予它鲜艳的颜色和极强的抗氧化能力，该能力可用于碎灭单逡逑线态氧和清除体内的自由基Ｍｌ。番茄红素可溶于油脂和部分有机溶剂如脂肪逡逑烃、芳香烃、苯、氯仿等，不溶于水、甲醇、乙醇等极性较强的溶剂。其化学逡逑性质活泼，易在富氧、紫外线照射条件下迅速氧化，而全反式结构相对更稳定逡逑［５－６］，因而自然提取来源的番茄红素多为这种结构。逡逑ｃｈ３邋ｃｈ３邋ｃｈ３逦ＩＬ逡逑ｊｌ逦ＣＨ３邋ｃｈ３邋ｃｈ３逡逑ｈ３ｃ邋ｃｈ３逡逑图１．１番茄红素的全反式分子结构逡逑１．１．２番茄红素的生理功能逡逑番茄红素可通过清除自由基来保护ＤＮＡ和蛋白质，进而保证细胞内的稳逡逑态。逡逑番茄红素可以与二氧化氮、过氧化氢等活性氧碎片之间发生氧化还原反应逡逑来消除自由基，它还可以通过吸收被激发的电子能量生成三重态的番茄红素，逡逑１逡逑
表２．１流动相洗脱梯度逡逑时间（ｍｉｎ）逦Ａ相：乙腈：水＝９：１邋（ｖ／ｖ）逦Ｂ相：乙酸乙ＢＳ逡逑０逦１００逦０逡逑１５逦０逦１００逡逑２５逦０逦１００逡逑２７逦１００逦０逡逑．番茄红素标准液配制及样品前处理逡逑制番红的标准溶液浓度分别为１邋ｍｇ／Ｌ，２邋ｍｇ／Ｌ，５邋ｍｇ／Ｌ，１０ｍｇ／Ｌ，２５邋ｍｇ／ＬＬ。制作标曲及确定出峰时间为１１．１５３邋ｍｉｎ邋（图２．１）。逡逑取０．０１邋ｇ邋（精确至０．０００１邋ｇ）样品于ｌＯＯｍＬ的容量瓶中，使用乙酸乙酯度（需保证样品完全溶解）。取出ｌｍＬ溶液置于丨ＯｍＬ容量瓶中，使用定容至刻度，混匀后过０．４５邋ｐｍ滤膜过滤后待测。逡逑９００－逡逑
尤其在通气量大时，一次性添加可能造成不必要的损失和浪费，且导逡逑致后续生物量增加时需要额外加大阻断剂用量，因此可以在生物量的对数生长期逡逑中期、末期分两次添加。如图２．２所示，５０邋Ｌ发酵罐验证实验中，生物量在４０邋ｈ左逡逑右到达平台期，以此为依据，计划分别在２０邋ｈ左右，４４邋ｈ左右各添加５０邋％的阻断逡逑剂。咪唑则可以在３２邋ｈ左右一次性添加。逡逑５０逡逑４５邋■逦—ＤＣＷ逦１逡逑４０邋■逦＾ｉＪ＋Ｉ逡逑３５逦ｙｒ＼逡逑ｇ邋：逦计划尼
本文编号：2770311
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/hxgylw/2770311.html
