超长链单不饱和脂肪酸生物合成途径的构建
发布时间：2020-07-26 07:44
【摘要】：神经酸(C24:1)是一种双键在15号碳上的二十四碳一烯酸,被称为世界上目前唯一一种具有修复受损神经纤维并促进其再生的物质,研究表明,神经酸可以延缓神经衰老,促进大脑发育,对心脑血管病、免疫系统疾病、某些皮肤病等有较好的效果。然而人体很难合成神经酸,主要从外界摄入,但是目前神经酸产量较低,市场需求较大,因此开发神经酸的生物合成方法具有重要的应用价值和理论意义。本课题选用酿酒酵母作为研究对象,通过构建产超长链单不饱和脂肪酸工程菌,探究了启动子类型、转录因子以及外源添加物等对酿酒酵母超长链单不饱和脂肪酸合成的影响。1、构建FAE1和KCS单基因工程菌,通过发酵结果分析,初步确定二者在超长链单不饱和脂肪酸延伸过程中的作用。分别采用组成型启动子PGK和半乳糖诱导型启动子GAL1构建FAE1和KCS单基因工程菌,发酵结果表明:相比半乳糖诱导型启动子GAL1,组成型启动子PGK对FAE1和KCS的表达具有更好的效果;FAE11单基因工程菌最终促进了 C20:1和C22:1的合成,而KCS单基因工程菌可以促进C20:1、C22:1及C24:0的合成且C20:1和C22:1的含量要低于FAE1基因工程菌,表明FAE1基因在C20:1和C22:1的延伸中起主要作用,而KCS基因可能在C24的延伸过程中起主要作用。2、探究多基因联合对神经酸合成的影响,根据神经酸的生物合成途径,在单基因工程菌的基础上构建了P TEF1-KCS-TCYC-PPGK-FAE1-TCYC双基因工程菌以探究双基因联合作用于超长链单不饱和脂肪酸的延伸,同时引入Mga2转录因子对酿酒酵母不饱和脂肪酸进行调控以加强神经酸的合成途径。发酵结果表明,在培养温度为22℃的条件下培养4天,PTEF1-KCS-TCYC-PPGK-FAE1-TCYC 双基因工程菌及 PTEF1-Mga2-TCYC-PPGK-KCS-TCYC-PPGK-FAE1-TCYC三基因工程菌最终检测到神经酸的生成。与PTEF1-KCS-TCYC-PPPGK-FAE1-TCYC双基因酵母相比,三基因工程菌中神经酸含量略有提高。3、优化培养条件促进超长链单不饱和脂肪酸的合成,通过初步探究外源添加不同脂肪酸、苹果酸、柠檬酸及生物素对神经酸合成的影响,发酵结果表明了外源添加油酸、苹果酸及生物素对神经酸的合成具有较好的促进作用,通过单因素优化,最终确定了外源分别添加油酸浓度为1.5mM、苹果酸浓度为0.2%、生物素浓度为1.5μg/L时,对C22:1、C24:1的合成具有较好的促进作用,最终使C22:1分别提高了 31%、77%、75%,使C24:1分别提高了 206%、140%、143%。采用分段式培养,最终确定了在28℃培养48h后转移至22℃培养至第6天时,C22:1和C24:1的含量有较为明显的提升,分别提高了 57%和200%。
【学位授予单位】：北京化工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ645.6
【图文】：
逑0逡逑图１－２神经酸结构式逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋－２邋Ｔｈｅ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｎｅｒｖｏｎｉｃ邋ａｃｉｄ逡逑１．１．２．２邋直接提取法逡逑直接提取法是指以富含芥酸或者神经酸的植物种子为原料，利用目标脂肪酸特定逡逑的沸点通过蒸馏等一系列方法分离得到芥酸或yL经酸。从油料作物种子中直接提取芥逡逑酸和神经酸是目前国内外主要的生产工艺，国内生产芥酸主要是从高芥酸油菜籽出发，逡逑将混合脂肪酸通过蒸馏、结晶、萃取等手段得到高纯度芥酸，具体流程如图１－３所示：逡逑Qi躺？水：逡逑———－ｒＪｕ．邋ｉ0ｒ邋－…逦逦邋－１５ｔ邋ｒ—，逡逑合＊辕肪酸＾一４秦q妫俊鋈芙猓ⅲ⒁唬蓿В删Х掷肜涠辰峋Х掷耄诲五危俊鲋亟峋Ь穑义县蒎危礤呜у义希核使龋В椋裕颍剩蓿螅恪危矗闄哄义希掊危翦危村义涎啊鲠幔危裕椋㈠吻Ы蒎义襄五五危澹五五义希耍渝澹殄危垮义希殄濉掊邃闱哲鶀U逦§ｍｍ逡逑｜炮和
本文编号：2770486
【学位授予单位】：北京化工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ645.6
【图文】：
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