大肠杆菌生物合成水杨酸

发布时间：2020-07-26 12:05

【摘要】：水杨酸在医药和化妆品行业有重要的应用,而粘糠酸则是塑料和多种化学品生产的重要前体化合物。传统的的生产模式在生产水杨酸和粘糠酸的过程中都会造成不可再生资源的消耗和环境污染,在这样的大背景下,新绿色生物合成的生产方式给当代发展带来了希望。本实验阐述了利用微生物大肠杆菌作为宿主生物合成水杨酸和粘糠酸的菌株构建和优化过程。在我们实验室之前的生物合成粘糠酸和水杨酸的研究基础,我们采用了RED基因重组的方法在大肠杆菌ATCC31884菌株的基因组上建立了一个水杨酸的高产平台。首先选取了不同强度启动子将合成水杨酸的基因整合到宿主细胞基因组上,通过莽草酸途径生产水杨酸,并找到了最优的菌株进行下一步优化;然后敲除了水杨酸生产途径的竞争途径,使水杨酸的产量增加一倍;再自下而上加强水杨酸的上游途径,为上游基因替换了强启动子之后发现水杨酸的产量是加强前的两倍;最后将菌株的水杨酸生产与细菌自身代谢生长相偶联。一步步的优化水杨酸的产量,最终得到水杨酸的摇瓶发酵产量为1.51 g/L。并利用该水杨酸高产平台发酵粘糠酸,得到粘糠酸摇瓶产量为 2.6g/L。本实验与已经报道的大肠杆菌生产水杨酸的方法不同,在水杨酸高产平台的构建中,抛弃了质粒构建的方法,直接采用了在大肠杆菌的基因组上重组合成水杨酸的基因,使得到的水杨酸高产菌株更为稳定,由此高产平台发酵下游产物也更加的方便简单。
【学位授予单位】：北京化工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ245.4;TQ920.1
【图文】：

逦逦逡逑图２－１邋ＲＥＤ重组示意图逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｔｈｅ邋ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｏｆ邋ＲＥＤ邋ｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ逡逑ＲＥＤ基因整合是一种比较传统的同源重组的方法。逡逑１．先用Ｏｖｅｒｌａｐ邋ＰＣＲ的方法将两个同源臂和卡那与目的基因的连接片断连接起逡逑

图３－１水杨酸生物合成途径逡逑蓝色箭头代表大肠杆菌自身的途径，紫色箭头代表外源途径；红色字代表敲除基因，绿色字代表逡逑加强基因。ＰＥＰ，磷酸烯醇式丙酮酸；Ｅ４Ｐ，赤藓糖４－磷酸；ＤＡＨＰ，邋１－羧基－２－脱氧－Ｄ－葡萄糖－６－逡逑磷酸；Ｐｙｒ，丙酮酸；ＩＣＳ，异分支酸合成酶；ＩＰＬ，异分支酸－丙酮酸裂解酶；ＰＰＡ，预苯酸；逡逑

逡逑图３－３邋Ｔ７ＲＮＡ聚合酶重组片段制备逡逑Ｍ为５０００ｂｐ邋ＤＮＡ邋ｍａｒｋｅｒ；邋２－３为Ｔ７ＲＮＡｐ－ＫＡＮ与上下游同源臂连接片段逡逑Ｆｉｇ．邋３－３邋Ｇｅｎｅ邋ｆｒａｇｍｅｎｔ邋ｏｆ邋Ｔ７ＲＮＡｐ邋ｆｏｒ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ逡逑Ｍ邋ｉｓ邋ａ邋５０００ｂｐ邋ＤＮＡ邋ｍａｒｋｅｒ；邋２－３邋ｉｓ邋ａ邋Ｔ７ＲＮＡｐ－ＫＡＮ邋ａｎｄ邋ｕｐｓｔｒｅａｍ邋ａｎｄ邋ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ邋ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ邋ａｒｍ逡逑ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ逡逑２６逡逑

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本文编号：2770744