小麦赤霉病菌Rab互作溶酶体蛋白对DON毒素生物合成的影响

发布时间：2020-07-27 10:28

【摘要】：小麦是世界三大粮食作物之一,小麦赤霉病是世界性的重要病害,不仅造成粮食作物的减产,还会产生大量真菌毒素威胁人畜安全,因此,防控小麦赤霉病具有重要意义。小麦赤霉病的病原菌主要为禾谷镰刀菌,其产生的DON毒素受很多因素的调控。Rab7蛋白作为调控蛋白,可通过与上游调节子和下游效应子结合协同发挥调控功能。RILP(Rab互作溶酶体蛋白)是Rab7的效应因子之一。禾谷镰刀菌中FgRab7影响DON毒素的生物合成,但FgRILP对DON毒素的影响未知。本研究对禾谷镰刀菌FgRILP的功能进行初探。通过生物信息学分析发现,FgRILP含有盐耐受负调控因子NST1蛋白、TolA蛋白、微管结合蛋白(MIP-T3)和Atrophin-1蛋白多个保守域;系统发育分析显示,禾谷镰刀菌PH-1的FgRILP与另一株禾谷镰刀菌的假定蛋白、黄色镰孢菌的胁迫反应蛋白在同一个分支,推测该基因与盐胁迫有关。运用同源重组技术构建了FgRILP基因敲除和过表达突变体,对突变体进行了盐胁迫和非胁迫下的表型分析。结果显示,在非盐胁迫条件下,突变体菌株与野生型的菌落形态无差异,但过表达突变体的菌丝生长更快,FgRILP敲除突变体菌丝生长减慢(p0.05);与野生型相比,FgRILP敲除突变体产孢量略有降低,FgRILP过表达突变体产孢量略有升高,FgRILP突变体和野生型的孢子萌发速率一致;FgRILP突变体和野生型均具侵染性,但FgRILP敲除突变体侵染力小于野生型和FgRILP过表达突变体,表明FgRILP基因与禾谷镰刀菌的生长发育、产孢量、致病性相关,对孢子的萌发和形态无影响。与非胁迫相比,在1.0M NaCl、0.08M LiCl及刚果红胁迫后,菌丝形态更稀疏,生长速度明显减慢(p0.01);盐胁迫下突变体与野生型菌株产生的分生孢子明显变形,产孢量、孢子萌发速率均显著降低,FgRILP突变体的产孢量均低于野生型;NaCl胁迫下,FgRILP敲除突变体的菌丝生长速率比野生型生更慢(p0.05),FgRILP敲除突变体致病力弱于野生型。暗示FgRILP基因在盐胁迫下对菌株生长、致病性等方面的调控作用。本研究进一步分析了FgRILP对DON毒素合成的影响。在小麦基质培养基中,非胁迫和NaCl胁迫下,FgRILP敲除突变体的DON合成量均显著低于野生型(p0.05);在0.08M LiCl胁下,FgRILP敲除突变体的DON合成量比野生型相稍高。在产毒液体培养基中,NaCl胁迫下,FgRILP敲除突变体的DON合成量显著低于野生型(p0.05);在0.08M LiCl胁迫下,FgRILP敲除突变体DON毒素的合成量略高于野生型。并且经过Tri5基因的表达量分析,发现在受NaCl胁迫下,其相对表达量与毒素测定结果相一致。表明FgRILP影响了禾谷镰刀菌DON毒素的合成,在盐胁迫下具有调控作用。本研究还利用酵母双杂交分析了FgRILP与FgRab7的相互作用情况,结果表明,FgRILP与FgRab7没有相互作用。但通过实时定量PCR分析两个基因的相对表达时发现,FgRILP在FgRab7敲除突变体中的相对表达量下调,FgRab7在FgRILP敲除突变体的表达量上调,可能FgRab7为了发挥调控作用,表达量上调,表明二者存在一定的相互关系。本研究对禾谷镰刀菌FgRILP的功能及对DON毒素合成的影响进行分析,研究结果为揭示DON毒素生物合成的分子调控机制奠定了基础,为开发新型靶标杀菌剂及减少真菌毒素的污染水平、保障农产品食用安全性提供了理论依据。
【学位授予单位】：河南工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S435.121.45;TQ455;TS201.6
【图文】：

质粒图谱,功能基因组学,福建农林大学,禾谷镰刀菌

2 材料与方法实验材料.1 供试菌株禾谷镰刀菌野生型（PH-1）菌株由许金荣博士赠予。大肠杆菌菌株 DH5α， AH109 由福建农林大学功能基因组学研究中心王宗华研究员惠赠。.2 致病性鉴定材料小麦种子（郑麦矮抗 58 号）从河南省农业科学院购买，西红柿由郑州市高小麦麦穗在郑州高新区采摘。.3 质粒载体pKNT-RP27-GFP、pGBKT7、pGADT7 载体，由福建农林大学功能基因组学赠，本实验室保存，质粒图谱如图 1 所示。

预测结果,蛋白

名为 FgRILP，其 ORF 全长为 3742bp，cDNA 为 3579bp，编码含有 1192 个氨基酸的蛋白。利用 NCBI 上的 CDD 功能对 FgRILP 蛋白进行保守域分析（图 2），发现 FgRILP具有多个保守域，在 175-273aa 区间有一个 NST1 保守域，NST1 属盐耐受调节因子，推测该基因在盐胁迫下具有调控作用；在 568-691aa 区间有一个 TolA_full 的保守域结构，TolA 将自身的内膜复合体与 TolQ 和 TolR 偶联到 TolB 和 Oprl 的外膜复合体（又称 PAl），Tol-PAl 复合物是维持外膜完整性所必需的，推测该保守域与物质转运和致病性相关；在 577-807aa 区间有一个 MIP-T3（Microtubule-binding protein）蛋白，其 N末端区域是微管结合结构域并且是保守的，C 末端 100 个残基也很保守，构成了与TRAF3 结合的卷曲螺旋区。在 709-1018aa 区间存在 Atrophin-1 蛋白保守域，该蛋白在动物中是进行性神经退行性疾病基因（Dentatorubral-pallidoluysian atrophy gene-DRPLA）的蛋白产物，其中 CAG（谷氨酰胺）重复序列与致病性相关，该保守域在真菌中的功能未知。

亚细胞定位,镰孢菌,镰刀菌

运用 softberry 在线软件中的 protein localization 分析显示，该基因编码的蛋白定位在细胞质（图 4）。XP 003042199.1 hypothetical protein NECHADRAFT 81283 Nectria haematococca mpVI 77-13-4KKP05144.1 hypothetical protein THAR02 02739 Trichoderma harzianumXP 013947360.1 hypothetical protein TRIATDRAFT 171742 partial Trichoderma atroviride IMI 20KFG80470.1 stress response protein nst1 Metarhizium anisopliaePOR33676.1 Stress response protein NST1 Tolypocladium paradoxumPNY25131.1 Stress response protein NST1 Tolypocladium capitatum100100870.05注：禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）、黄色镰孢菌（Fusarium culmorum）、长柄镰刀菌（Fusariulangsethiae）、黎孢镰刀菌（Fusarium pose）、燕麦镰孢菌（Fusarium avenaceum）、尖孢镰刀菌（Fusariuoxysporum）、血链球菌（Nectria haematococca）、串珠镰刀菌（Fusariμm verticillioides）、层生镰刀菌（Fusariuproliferatum）、水稻恶苗病菌（Fusarium fujikμroi）、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）、绿僵菌（Metarhiziuanisopliae）、绿色木霉（Trichoderma viride）、头状虫草（Tolypocladium capitatum）、大团囊虫草(Tolypocladiuparadoxum)。图 3 FgRILP 系统发育树FIg. 3 Phylogenetic tree of FgRILP

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