基于质谱技术的寡核苷酸分离分析方法研究

发布时间：2020-08-04 10:51

【摘要】：寡核苷酸作为一类序列较短的核酸分子,是生命科学和生物医学研究中调节基因表达的基本工具。人工合成的寡核苷酸通过化学修饰可以增加其在生物体内的稳定性,并被开发为基因治疗靶向药物,用于许多与基因相关的疾病如病毒、肿瘤和遗传病等的治疗。与此同时,如何快速、有效、准确地鉴别寡核苷酸所携带的修饰类型以及修饰位点也为其分离分析方法的开发带来了挑战。核酸和蛋白质是两类密切相关的生物大分子,通过彼此间的相互作用可以对各自的生命周期和生物学功能进行调节。核酸蛋白间的相互作用是决定细胞内平衡的关键因素,破坏核酸蛋白的相互作用将会导致细胞的功能紊乱以及相关疾病的发生。核酸与蛋白相互作用的研究涉及寡核苷酸与多肽的液相质谱联用分析,而寡核苷酸和多肽分子所存在的理化性质差异使得两者的同时分析难以实现。基于寡核苷酸质谱分析的现实需求和研究难点,包括传统离子对试剂引起的寡核苷酸质谱信号抑制、寡核苷酸在质谱正离子模式灵敏度低、寡核苷酸难以和多肽在正离子模式同时进行液相质谱联用分析以及寡核苷酸化学修饰和序列信息的快速鉴定等,本论文针对性地提出了改进的分析策略,具体内容包括以下三部分:有机气氛辅助的电喷雾离子化策略用于提高寡核苷酸的质谱检测灵敏度:寡核苷酸的液相质谱联用分析主要存在两方面的挑战,分别是由离子对试剂引起的质谱信号抑制以及寡核苷酸在质谱正离子模式下的灵敏度较低。我们通过将高浓度的醇类气氛引入封闭的电喷雾离子源,成功缓解了高浓度离子对试剂(100mM TEAA)所引起的寡核苷酸在质谱负离子模式下的信号抑制效应。在该缓冲体系中,相比于常规离子化方式,寡核苷酸样品dT15在异丙醇气氛的辅助下,其质谱信号强度提高了约600倍。随后,寡核苷酸的高效液相分离和高灵敏度质谱检测得以同时实现。另外,通过丙酸气氛的辅助,寡核苷酸得以在质谱正离子模式下成功检测,且并无明显加合峰出现。相比于直接通过溶液加酸的方式,丙酸气氛辅助下的寡核苷酸质谱正离子模式信号强度提高至少10倍以上。最后,通过丙酸气氛辅助的离子化策略,寡核苷酸和多肽以及组蛋白样品得以同时在正离子模式下进行分析,且相互之间干扰并不明显。总而言之,有机气氛辅助的离子化策略将会对寡核苷酸的生物学功能探索提供有效的帮助。离子对反相色谱与正离子模式质谱联用下的寡核苷酸分离分析:由于自身携带有电负性极强的磷酸二酯骨架结构,寡核苷酸通常通过离子对反相色谱与负离子模式下的电喷雾质谱联用进行分析。我们通过显著提高源内裂解能量,成功缓解了由离子对试剂三乙胺和六氟异丙醇引起的寡核苷酸在质谱正离子模式下的大量三乙胺加合峰干扰。随后,我们将该策略用于RNA型寡核苷酸的酸解测序分析,发现正离子模式下的测序结果较传统负离子模式更具优势。最终,采用该策略,我们成功实现了寡核苷酸样品与多肽样品在正离子模式下的离子对反相色谱质谱联用分析,且相互间的干扰较少。采用不同基质辅助的激光解析质谱源内裂解下的小干扰RNA的修饰位点鉴定及序列表征:人工合成的医用siRNA由于携带大量的化学修饰以及其裂解碎片在电喷雾离子化过程中容易携带多电荷产生信号干扰,通过串联质谱进行序列鉴定其质谱结果通常过于复杂且难以分析。我们通过激光解析质谱的源内裂解方式并配合不同的基质sDHB和3-HPA对多修饰的siRNA样品SR-2M2-AS进行了修饰位点鉴定和序列表征。siRNA源内裂解的主要碎片类型与所用基质密切相关,采用基质sDHB得到d/y型碎片离子而采用基质3-HPA则得到了a/w型碎片离子,而两种基质分别得到的源内裂解结果都可用于siRNA的快速测序。另外,2'-F修饰将会阻止院内裂解碎片的产生,对此我们提出了相应的裂解机理。在掌握了不同基质下的siRNA源内裂解规律后,这必将成为一种快捷、简单、准确和有效的用于siRNA修饰位点鉴定和序列分析的方法。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：O657.63;TQ464.6
【图文】：

机理,人工合成,磷酸化,复合物

［２４１。逡逑如图１．２所示为整个ＲＮＡｉ的作用通路［２５，２６］。首先，当蛋白Ｄｉｃｅｒｔ２７１将ＲＮＡ逡逑剪切成２１到２５个核苷酸链长时，整个ＲＮＡｉ通路正式开启Ｉ２８】。这些小ＲＮＡ邋（包逡逑括ｓｉＲＮＡ和ｍｉＲＮＡ）将被整合成ＲＮＡ介导的沉默复合物（ＲＮＡ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ逡逑ｃｏｍｐｌｅｘ，邋ＲＩＳＣ）邋［２９】，这也是大部分人工合成的ＲＮＡｉ效应分子进入作用通路的逡逑起点。当然，人工合成的ｓｉＲＮＡ分子需要通过激酶Ｃｌｐｌ将其５’端磷酸化后才会逡逑被激活ｌ３Ｇ］。在ｓｉＲＮＡ的５’端被磷酸化之后，ＲＩＳＣ复合物会与双链ｓｉＲＮＡ中的逡逑１２逡逑

原理图,反相色谱,寡核苷酸,离子对

谱的基础上在流动相中加入了离子对试剂（也就是各种带正电的胺类化合物），逡逑以增强其与寡核苷酸的相互作用。逡逑如图１．４所示，离子对试剂增强寡核苷酸在反相色谱上的保留原理主要基于逡逑两点：首先，带正电的离子对试剂会与带负电的寡核苷酸磷酸骨架在溶液中构成逡逑离子对，减少了寡核苷酸的净电荷并增加了其疏水性，此时疏水相互作用促成了逡逑寡核苷酸在离子对反相色谱中的保留；再者，离子对试剂依靠其疏水性烷基链可逡逑以吸附于反相色谱的固定相上以形成离子交换剂（Ｉｏｎ邋ｅｘｃｈａｎｇｅｒ），此时静电相逡逑互作用将帮助寡核苷酸在反相色谱中的保留［８３，８４］。逡逑／，邋？邋°逡逑Ｉｏｎ邋ｐａｉｒｉｎｇ邋ｉｎ邋ｓｏｌｕｔｉｏｎ逦０0—ｐ＝0逡逑0邋Ｗ逡逑＾邋Ｈ６ｉＨＨ逡逑Ｉｏｎ邋ｅｘｃｈａｎｇｅ逦Ｑ0—ｐ＝ｏ逡逑＼ｆ＾逦Ｈ邋Ｏ邋ＯＨ逡逑ｅ0－ｆ＝0逡逑／ｎ逦Ａｔｒ逡逑——Ｓｉ—逡逑（ｉ逡逑图１．４寡核苷酸在离子对反相色谱上的保留原理。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．４邋Ｓｃｈｅｍｅ邋ｏｆ邋１Ｐ－ＲＰＬＣ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍ邋ｏｆ邋ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ邋ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ．逡逑Ｉ逡逑１９逡逑

液相分离,寡核苷酸,质谱,浓度

Ｄｉｃｋｍａｎ等证明用添加ＴＥＡＡ的离子对反相色谱可以实现长达４５８ｂｐ的双链逡逑ＤＮＡ分子的分离分析心，％。逡逑如图１．５所示，ＴＥＡＡ的浓度直接关系到分离效果，寡核苷酸分离所用的逡逑ＴＥＡＡ浓度通常需要１００ｍＭ以及采用ｐＨ＝７的乙腈流动相体系。如此高浓度的逡逑ＴＥＡＡ流动相体系，寡核苷酸难以在质谱中产生信号，紫外检测器几乎成为标配逡逑［９１］。最近，Ｇｏｎｇ等在优化了各项液质条件后得出ＴＥＡＡ浓度在３０ｍＭ可以兼顾逡逑核酸的液相分离度和质谱的检测灵敏度［９２］。逡逑ＴＥＡＡ总共有两部分组成，三乙胺和乙酸。其中，三乙胺是寡核苷酸分离分逡逑析最为常用的离子对试剂，故而，大量的研究聚焦于抗衡离子（Ｃｏｕｎｔｅｒｉｏｎ）乙逡逑酸根离子对于质谱信号的影响＾在电喷雾离子化去溶剂的过程中，三乙胺（８９°Ｃ）逡逑和乙酸（１１８°Ｃ）的沸点差异将起到决定性的作用［４２］。当离子对反相色谱与质谱逡逑联用时，三乙胺在电喷雾液滴中的蒸发速度明显快于乙酸，而乙酸在电喷雾液滴逡逑中的大量聚集会降低体系的ｐＨ值，并通过与寡核苷酸的离子化过程产生竞争从逡逑而降低了寡核苷酸的离子化效率

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