纳米材料与核酸组装体应用于药物递送和循环肿瘤细胞的检测

发布时间：2020-08-11 23:51

【摘要】：由于纳米材料具有独特的物理和化学性质,已经成为制造新型光学纳米探针的优质材料。纳米材料的性能高度依赖于其可调控的尺寸和形状,当它们与特定的信号转导机制组件结合时,可以显著的提高对分析物检测的灵敏度和特异性。本课题的主要研究内容概括如下:(1)由于抗肿瘤药物具有疏水性和不稳定等缺点,而纳米载体能有效改善的药物的疏水性,并促进药物的递送和细胞的摄取。在此,我们构建了一种多功能球形核酸纳米胶束药物递送系统,具有高效的药物递送率和治疗效果。首先,利用辅助分离材料磁性微球-金纳米颗粒(MB-AuNPs),通过磁性分离技术,有效提高了紫杉醇-核酸(PTX-DNA)复合物的分离效率。其次,利用DNA作为亲水端和PTX作为疏水端,合成PTX-DNA两性纳米胶束单体。将PTX-DNA单体与PTX-DNA/FAM单体自组装形成球形纳米胶束。且球形纳米材料比其他形状的材料更容易被细胞吞噬,有效的提高了PTX的递送率。使用生物还原活化的二硫化物将疏水性PTX与DNA连接。当纳米胶束被细胞摄取后,在谷胱甘肽(GSH)存在下,二硫键被切割使纳米胶束散开,成功实现PTX的释放。该方案具有高效的分离效率,成功实现每个步骤的分离时间仅为60 s,极大的缩短了材料的合成时间,避免了耗时且劳动密集等缺点。通过荧光显微镜和流式细胞术证明PTX-DNA纳米胶束的成功摄取和药物的成功释放。所合成的纳米胶束具有更优的亲水性、更好的生物相容性、更高的稳定性、单分散尺寸和更高的治疗潜力。我们相信该方法在临床研究应用等方面,具有重大的研究潜力。(2)循环肿瘤细胞(CTCs)是指具有高活力和转移潜能的肿瘤细胞。因此,CTCs的检测对早期肿瘤的临床诊断具有重要意义。近年来,不同纳米结构在基底上的整合和相应特异性识别分子的修饰已成为CTCs从全血样品中高效捕获的最常用方法。粗糙的纳米界面具有较大的比表面积,可以连接更多的适体DNA,有效的增加了CTCs的捕获率;但粗糙界面极易造成非特异性细胞粘附,导致假阳性的存在。因此,通过利用抗污染分子能够有效的降低非靶细胞的粘附。聚乙二醇(PEG)分子在“软”基质上进行修饰能有效改善界面的亲水性,同时降低细胞的非特异性粘附。在此,我们设计了一种基于抗污染材料PEG的金纳米花基底高效捕获和无损伤释放CTCs。一方面,该平台使用的虚拟PEG模板既能提高界面的生物相容性,又能有效地控制非特异性细胞粘附;另一方面,金纳米花基底具有粗糙的表面,显著提高适体在金纳米花基底的连接效率来增加CTCs的捕获效率。在金纳米花基底上,使用DNA适体功能化后表现出优异的捕获特异性。与其他纳米结构相比,及时在低细胞密度下,金纳米花基底具有较大的捕获能力。通过对释放后的CTCs进行培养,细胞活力和增殖情况均表现正常。这项工作为少量CTCs的高效捕获和无损伤释放提供了策略,我们相信它在临床检测方面具有较大的潜力。(3)CTCs在外周血中含量非常低,在1000万个白细胞和50亿个红细胞中含有1-10 CTCs/mL,因此高灵敏性检测大量正常细胞中少量的CTCs是极其困难的。基于贵金属纳米粒子的独特性质,表面增强拉曼散射技术(SERS)可以极大地放大单分子的光谱信号。因此,基于SERS的检测方法可以为CTCs检测提供多种策略的强大分析工具。在此,我们开发了一种基于金纳米星(AuNS)和杂交链式反应(HCR)多重拉曼信号增强机制,以及DNA适体和AE的双重识别机制,高灵敏检测和高特异性识别CTCs。通过构建信号探针:在AuNS表面功能化PEG分子,具有较高的稳定性并且减少非特异性捕获吸附,同时提供氨基,以便后续连接引发链DNA和抗-上皮细胞粘附分子(AE)。其中通过引发链DNA引发修饰ROX的发卡H1和发卡H2,实现HCR,产生强烈的SERS信号。当通过修饰在金纳米花基底上的DNA适体和信号探针上的AE,双重识别CTCs,极大的提高了复杂全血样品中的细胞捕获的特异性。之后,适体互补链被用与适体DNA杂交以实现修饰有信号探针HCR/AE/PEG/AuNS的CTCs的释放。在最佳释放条件下,可以实现完全释放和收集CTCs以检测拉曼信号。实现在1至100 cells/mL范围内,具有良好的线性,并且检测限达到1 cell/mL。
【学位授予单位】：青岛科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ460.1;O657.3
【图文】：

纳米,纳米材料,高灵敏度,性质

料具有独特的化学性质，通过调控其形状和结构，使纳米材料灵敏度和特定性能[1]。纳米材料的这种独特性质以及他们整体用于多种传感器的巨大潜力。因此，已经开发了基于多种纳米法，例如金纳米材料[2-5]，量子点[6]，壳聚糖纳米材料[7-8]，纳米测分析物的高灵敏度，在免疫测定中使用光学纳米探针开发信极大的关注。然而，由于酶与检测抗体之间的比例为 1：1，常受到限制。为了实现高灵敏度这一目标：一方面，利用纳米，增加多种信号探针（例如，生物分子，荧光染料和拉曼报道有效的放大信号；另一方面，在生化反应的帮助下产生的指示放大。材料的性质纳米材料的高灵敏免疫分析方法中，纳米材料的特性具有较-1 所示，纳米材料的局部等离子共振（LSPR）性质、纳米材米材料的表面增强拉曼（SERS）性质。

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基于 AChE 催化的水解反应的比色测定方案，用于检测肠病毒 71（EVhE 催化乙酰胆碱的水解，生成乙酸和胆碱。（b）改进的夹心 ELISA 形-2 Scheme of the colorimetric assay based onAChE-catalyzed hydrolysis ref enterovirus 71 (EV71)[16]. (a)AChE catalyzes the hydrolysis of acetylcholiacetate and choline. (b) The improved sandwich ELISA format.距离的变化之外，尺寸的变化是设计比色传感器的另一个有 1-3 所示，基于酶促的控制 AuNPs 活性的信号产生机制被定中的蛋白质的超灵敏检测[17]。在该方法中，首先通过特，所述特异性抗体在固体基质上预先固定，随后通过第二抗体消耗过氧化氢，并且其活性与 AuNPs 的生长相关，以在存情况下产生蓝色或红色溶液。在不存在分析物的情况下，金化氢存在下迅速降低，这有利于形成具有红色的球形非聚，在存在分析物的情况下，酶导致过氧化氢浓度降低，这聚集的纳米颗粒的不明确的形态。蓝/红色变化允许用肉眼检

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1-2 基于 AChE 催化的水解反应的比色测定方案，用于检测肠病毒 71（EV71）AChE 催化乙酰胆碱的水解，生成乙酸和胆碱。（b）改进的夹心 ELISA 形式。ig. 1-2 Scheme of the colorimetric assay based onAChE-catalyzed hydrolysis reactioion of enterovirus 71 (EV71)[16]. (a)AChE catalyzes the hydrolysis of acetylcholine toacetate and choline. (b) The improved sandwich ELISA format.了距离的变化之外，尺寸的变化是设计比色传感器的另一个有吸引图 1-3 所示，基于酶促的控制 AuNPs 活性的信号产生机制被开测定中的蛋白质的超灵敏检测[17]。在该方法中，首先通过特异性子，所述特异性抗体在固体基质上预先固定，随后通过第二抗体用以消耗过氧化氢，并且其活性与 AuNPs 的生长相关，以在存在或的情况下产生蓝色或红色溶液。在不存在分析物的情况下，金离子氧化氢存在下迅速降低，这有利于形成具有红色的球形非聚集金而，在存在分析物的情况下，酶导致过氧化氢浓度降低，这导致的聚集的纳米颗粒的不明确的形态。蓝/红色变化允许用肉眼检测

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