L-天冬氨酸α-脱羧酶热稳定性改造及全细胞催化制备β-丙氨酸

发布时间：2020-08-12 07:13

【摘要】：L-天冬氨酸α-脱羧酶(L-aspartateα-decarboxylase,EC4.1.1.11,ADC)催化L-天冬氨酸脱去α羧基生成β-丙氨酸。β-丙氨酸在食品、医药、化工等领域具有广泛应用,合成方法主要有化学合成法和生物合成法。相较于化学合成法,生物合成法具有副产物少,操作简便,绿色环保等优点。但是用于催化生成β-丙氨酸的ADC酶活普遍偏低,限制了β-丙氨酸的生物法大规模制备。基于此,本研究对赤拟谷盗来源ADC进行分子改造,提升其催化性能,并利用全细胞催化法制备β-丙氨酸。主要研究结果如下:(1)依据嗜热蛋白的氨基酸内在进化趋势,将位于酶分子表面的Lys和Gly分别突变为Arg和Ala,成功提高了该酶的稳定性。共构建22个突变体。初筛结果显示,大多数突变体酶活及稳定性较野生型相差不大,其中,K49R、K221R、G369A突变体显示出较好的催化性能。酶学性质测定结果表明,K221R突变体比酶活较野生酶提高20.3%;在50℃处理30 min,K49R、K221R和G369A的残余酶活较野生酶提高0.7倍、1.2倍和1.0倍。分子动力学模拟结果显示,突变体K221R、G369A的柔性区域较野生型减少,并且与周围氨基酸产生相互作用力,推测是其热稳定性增强的原因。(2)构建基因工程菌,建立全细胞催化生产β-丙氨酸工艺。研究比较了一次性加入高浓度底物、多次添加底物分批补料催化工艺,野生型菌株最佳补料次数是3次,转化生成β-丙氨酸1079.9 mmol·L~(-1),摩尔转化率为90.0%;K221R菌株和G369A菌株最佳补料次数为4次,转化生成β-丙氨酸分别为1512.2 mmol·L~(-1)和1509.6 mmol·L~(-1),摩尔转化率分别达到94.5%和94.4%。(3)对K221R菌株进行5 L发酵罐高密度发酵实验。通过对诱导剂种类和浓度进行优化,确定最佳诱导剂浓度为终浓度0.8 mmol·L~(-1) IPTG。发酵53 h左右菌体量达到OD_(600)=130,最高酶活为851.6 U·mL~(-1)。采用高密度发酵菌株进行全细胞催化,生成β-丙氨酸1820.0 mmol·L~(-1),摩尔转化率达到91.0%。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ922.2
【图文】：

示意图,裂解机理,示意图,乙酰基转移酶

江南大学硕士学位论文结构相似，同为四聚体，前者分子量略大，其 C 末端比 E. coli 多 13 个氨基酸[19]。Cglutamicum 来源的 ADC 不需 panM 蛋白（一种可以促进 ADC 自裂解的乙酰基转移酶同源蛋白）的辅助[20, 21]，可以通过自剪切过程形成有活性的成熟酶，其应用性更强。

示意图,化学结构式,磷酸吡哆醛,亚磺酸

图 1-1 E. coliADC 裂解机理示意图. 1-1 Cleavage mechanism ofADC from E磷酸吡哆醛（PLP）依赖型酶[11]。ADC）和谷氨酸脱羧酶（GAD）有为半胱氨酸亚磺酸脱羧酶类或谷氨中于其代谢产物在影响昆虫角质明确。-Ala），又名 β-氨基丙酸。分子式色棱形结晶，熔点为 200℃，暴露2。

L-天冬氨酸,脱羧酶,酶活,突变体

图 3-1 表面 Lys 和 Gly 在 L-天冬氨酸 α-脱羧酶中的位置a: 红色表示赖氨酸，绿色表示甘氨酸；b: 由图 a 翻转一定角度得到Fig. 3-1 The distribution of Lys and Gly inADC three-dimensional structureThe distribution of Lysine and Glycine, red is Lysine and green is Glycine ; b: The graph a rotatecertain angle to get the b graph 突变体的初步筛选初步筛选酶活和热稳定性提高的突变体。取野生型和突变型粗酶液于 37℃反检测酶活，检测结果如图 3-2 所示。在 K→R 系列突变体中，大部分突变体均以上的酶活，其中 K190R、K220R、K221R、K305R、K480R 酶活较野生型有提升；在 G→A 系列突变体中，G282A 酶活仅剩 40%，G369A 酶活有所提高变体与野生型酶活相差不大。

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