枯草芽孢杆菌菌株改造、启动子优化和普鲁兰酶的高效制备研究
发布时间：2020-08-12 10:54
【摘要】：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被美国食品和药物管理局列为原则上认为安全的微生物(GRAS),并且具有较强的蛋白分泌能力,因此,被广泛用于外源蛋白的表达。本实验室前期工作中从自然界筛选得到了一株菌体生长及分泌蛋白性能优良的枯草芽孢杆菌,但它存在很多野生性状,不适合直接作为外源基因表达宿主菌。本研究通过建立枯草芽孢杆菌CRISPR/Cas9基因编辑系统对该菌株进行一系列改造,并通过启动子筛选得到一种适用于该菌株的双启动子表达载体。本研究所用的模型酶包括用于环糊精生产的β-环糊精葡萄糖基转移酶(β-CGTase)和α-环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGTase)以及用于淀粉脱支的普鲁兰酶,其中重点对普鲁兰酶的制备进行了研究。主要结果如下:(1)在枯草芽孢杆菌中建立了CRISPR/Cas9基因编辑系统,并经过基因敲除获得了发酵性能改善的菌株。以B.subtilis ATCC 6051_a为宿主菌建立CRISPR/Cas9基因编辑系统,构建了敲除质粒,包括sg RNA、cas9基因、同源修复臂、大肠杆菌复制原点p15A、温度敏感的复制原点PE194、氨苄青霉素筛选标记基因和四环素筛选标记基因。采用该基因编辑系统逐步敲除B.subtilis ATCC 6051a中的srf C、 spo IIAC、npr E、apr E和amy E基因,依次得到产泡沫量减少的菌株BS1、产芽孢率降低的菌株BS2、胞外蛋白酶活性降低的菌株BS3及BS4和淀粉酶活性降低的菌株BS5。采用上述方法对本实验室筛选的菌株进行改造,逐步敲除srf C,spo IIAC,amy E,npr E和apr E基因,得到菌株WS5。(2)以β-CGTase为模型酶在菌株WS5中进行启动子的筛选优化。首先通过摇瓶发酵考察九个单启动子P_(amy Q/Ba)、P_(srf)、P_(xyl)、P_(gsiB)、P_(xyl/Bm)、P_(Hpa II)、P_(amy Q)、P_(apr E)和(P_npr E)对β-CGTase表达水平的影响,获得表达量最高的单启动子P_(amy Q)。在此基础上构建六个双启动子P_(srf)-P_(amy Q)、P_(xyl)-P_(amy Q)、P_(gsi B)-P_(amy Q)、P_(Hpa II)-P_(amy Q)、P_(amy Q)-P_(amy Q)和P_(npr E)-P_(amy Q),摇瓶发酵筛选出表达量最高的双启动子P_(Hpa II)-P_(amy Q)。荧光定量PCR检测表明双启动子P_(Hpa II)P_(amy Q)相比单启动子P_(amy Q)和P_(amy Q/Ba),启动强度较强。采用双启动子P_(Hpa II)-Pamy Q’表达普鲁兰酶和α-CGTase,摇瓶发酵48 h时酶活分别为90.69和9.51 U·m L-1。3-L罐发酵时双启动子P_(Hpa II)-Pamy Q介导的普鲁兰酶酶活可达623.17 U·m L-1,SDS-PAGE电泳分析表明此时蛋白酶降解程度较明显。(3)六种胞外蛋白酶基因的敲除和普鲁兰酶重组菌发酵条件优化。在菌株WS5的基础上敲除了剩余的六种胞外蛋白酶基因,得到菌株WS11。摇瓶发酵α-CGTase和β-CGTase在菌株WS5和WS11中酶活无明显差异,而普鲁兰酶在菌株WS11中的酶活相比菌株WS5中下降了26.2%。3-L罐发酵时普鲁兰酶在宿主菌WS11中的酶活可达174.47U·m L-1,SDS-PAGE电泳分析表明此时普鲁兰酶受胞外蛋白酶降解程度相比宿主菌WS5时明显减弱。对以菌株WS11为宿主的普鲁兰酶重组菌WS11PUL进行摇瓶发酵优化和3-L罐发酵优化,最终3-L罐发酵酶活可达1047.58 U·m L-1,是摇瓶发酵的9.48倍。(4)研究蛋白酶对普鲁兰酶表达的影响,并通过优化3-L罐发酵补料培养基进一步提高普鲁兰酶表达量。摇瓶发酵研究九种普鲁兰酶重组菌WS3PUL到WS11PUL中普鲁兰酶的酶活,发现重组菌WS5PUL的酶活最高。对重组菌WS5PUL、WS9PUL、WS10PUL和WS11PUL进行3-L罐发酵实验,发现重组菌WS9PUL胞外酶活最高,为2449.62 U·m L-1,是重组菌WS5PUL最高酶活(2094.98 U·m L-1)的1.17倍。重组菌WS5PUL、WS9PUL、WS10PUL和WS11PUL 3-L罐发酵样品的动力学参数和热稳定性表明胞外普鲁兰酶的折叠水平随蛋白酶敲除个数的增加而有所下降。最后对重组菌WS9PUL 3-L罐发酵补料培养基进行优化,当碳源葡萄糖和氮源玉米浆及酵母浸膏的比例为4/1时,胞外酶活在99 h达到最高5951.84 U·m L-1。(5)研究了伴侣蛋白对普鲁兰酶表达的影响。在宿主菌WS11中hrc A基因的敲除,伴侣蛋白基因prs A和csa A分别连到游离质粒p BE-S194上表达,以及伴侣蛋白基因prs A、csa A、dna K和dna J分别连到普鲁兰酶表达质粒p HYPULd4上表达对普鲁兰酶的表达都没有明显的正效果,而伴侣蛋白基因grp E连到质粒p HYPULd4上表达使普鲁兰酶胞外表达量提高了13%。同时在宿主菌WS4和WS5中伴侣蛋白基因grp E连到质粒p HYPULd4上共表达使普鲁兰酶表达量提高4.53%和8.19%,而在宿主菌WS9和WS10中没有正效果。(6)研究了细胞壁D-丙氨酸酯化调节基因dlt B和自溶素编码基因lyt C的敲除对普鲁兰酶表达的影响,并通过信号肽筛选进一步提高普鲁兰酶胞外表达量。宿主菌WS9通过dlt B基因的敲除得到宿主菌WS9D,并使得普鲁兰酶摇瓶发酵表达量提高了48%。宿主菌WS9中lyt C基因的敲除使得普鲁兰酶摇瓶发酵表达量提高了24%,而宿主菌WS9D中的lyt C基因的敲除对普鲁兰酶摇瓶发酵表达量没有明显影响。采用高通量的方法筛选到两个适合普鲁兰酶分泌的信号肽,分别为ywt F基因信号肽和phr K基因信号肽。在宿主菌WS9D中采用ywt F基因信号肽时普鲁兰酶3-L罐发酵酶活可达8037.91 U·m L-1,是目前资料报道的普鲁兰酶最高发酵水平。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ920.1
【图文】：
杆菌中不同分泌途径信号肽[73]。A：Sec 分泌途径；B：Tat 分泌途径；泌途径；D：Com 分泌途径nal peptides of different pathway in B. subtilis. A: Sec pathway; B: Tat pathwpathway; D: Com pathway的概述（EC 3.2.1.41）是一种被广泛使用的淀粉脱支酶，它可以水解支链淀粉、α-糊精、β-糊精、糖原和相关多糖中的 α-1，6 糖苷普鲁兰酶单独作用或与其它淀粉分解酶如糖化酶、α-淀粉酶、基转移酶复配作用时，可以把淀粉分解成直链淀粉或小的还原的应用于乙醇燃料、环糊精、抗性淀粉、麦芽三糖糖浆等产品生型菌中的表达都较低，在 BacillusflavothermusKWF-1[76]和 An活只有 0.171 和 3.86 U·mL-1。随着 DNA 重组技术的发展，物宿主中得到表达，包括大肠杆菌[78]、枯草芽孢杆菌[79]、地衣芽[81]、毕赤酵母等[82]，目前其胞外最高酶活分别为 1567.9、24.5、1L-1。
B. subtilis ATCC 6051a 发酵时会产生大量的泡沫，需要添加大量的消泡剂来抑制的产生，不利于发酵过程的控制，且容易染菌。发酵过程中产生的两亲分子枯草菌进泡沫的产生，而 srfC 基因对于调节枯草菌素的产生很重要。如图 2-3 所示，采用构建的 CRISPR/Cas9 基因编辑系统敲除质粒 pHYcas9dsrf1 对 srfC 基因进行敲除。转化敲除质粒 pHYcas9dsrf1 到 B. subtilis ATCC 6051a，敲除质粒在菌体细胞内合as9 蛋白和 sgRNA，Cas9 蛋白在 sgRNA 指引下特异性的切割 srfC 基因处靶位点，然同源修复臂的指引下菌体内的同源修复系统特异性的修复靶位点，删除 6 个碱基并一个 XhoI 酶切位点和 5 个随机碱基，使 srfC 基因发生移码突变失活。筛选敲除成变子时，首先在同源修复臂外围的序列处设计验证引物对转化子进行菌落 PCR，对产物进行 PCR 产物纯化，然后进行 XhoI 酶切，敲除成功突变子的 PCR 验证产物可 XhoI 酶切开，并且 PCR 验证产物测序正确。随后对敲除成功突变体中的敲除质粒 51 ℃划线热消除。XhoI 酶切验证（图 2-4）和测序检验 srfC 基因敲除成功，敲除菌株命名为 BS1。转化 pHYcas9dsrf1 后有 66 ±14 个转化子，挑取 30 个转化子进证，有 13 ±2 个菌落敲除成功，敲除效率为 43% ±6%，结果表明 CRISPR/Cas9 基辑系统在枯草芽孢杆菌中是一种高效的基因编辑方法。
除核酸电泳验证。M：DL2000 MT：突变型firmation of the frameshift mutatio对菌株 B.subtilisATCC605株 B.subtilisATCC6051a 产 490 μL，而菌株 BS1 产生 h 后两株菌泡沫高度相似， B.subtilisATCC6051a 中 sr产生。菌株 B.subtilisATCCBS1 在发酵 66 h 菌体干重达发酵前 66 h 菌株 B. subtilis菌体的生长可能有一些影响较快一些，可能和其发酵过
本文编号：2790441
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ920.1
【图文】：
杆菌中不同分泌途径信号肽[73]。A：Sec 分泌途径；B：Tat 分泌途径；泌途径；D：Com 分泌途径nal peptides of different pathway in B. subtilis. A: Sec pathway; B: Tat pathwpathway; D: Com pathway的概述（EC 3.2.1.41）是一种被广泛使用的淀粉脱支酶，它可以水解支链淀粉、α-糊精、β-糊精、糖原和相关多糖中的 α-1，6 糖苷普鲁兰酶单独作用或与其它淀粉分解酶如糖化酶、α-淀粉酶、基转移酶复配作用时，可以把淀粉分解成直链淀粉或小的还原的应用于乙醇燃料、环糊精、抗性淀粉、麦芽三糖糖浆等产品生型菌中的表达都较低，在 BacillusflavothermusKWF-1[76]和 An活只有 0.171 和 3.86 U·mL-1。随着 DNA 重组技术的发展，物宿主中得到表达，包括大肠杆菌[78]、枯草芽孢杆菌[79]、地衣芽[81]、毕赤酵母等[82]，目前其胞外最高酶活分别为 1567.9、24.5、1L-1。
B. subtilis ATCC 6051a 发酵时会产生大量的泡沫，需要添加大量的消泡剂来抑制的产生，不利于发酵过程的控制，且容易染菌。发酵过程中产生的两亲分子枯草菌进泡沫的产生，而 srfC 基因对于调节枯草菌素的产生很重要。如图 2-3 所示，采用构建的 CRISPR/Cas9 基因编辑系统敲除质粒 pHYcas9dsrf1 对 srfC 基因进行敲除。转化敲除质粒 pHYcas9dsrf1 到 B. subtilis ATCC 6051a，敲除质粒在菌体细胞内合as9 蛋白和 sgRNA，Cas9 蛋白在 sgRNA 指引下特异性的切割 srfC 基因处靶位点，然同源修复臂的指引下菌体内的同源修复系统特异性的修复靶位点，删除 6 个碱基并一个 XhoI 酶切位点和 5 个随机碱基，使 srfC 基因发生移码突变失活。筛选敲除成变子时，首先在同源修复臂外围的序列处设计验证引物对转化子进行菌落 PCR，对产物进行 PCR 产物纯化，然后进行 XhoI 酶切，敲除成功突变子的 PCR 验证产物可 XhoI 酶切开，并且 PCR 验证产物测序正确。随后对敲除成功突变体中的敲除质粒 51 ℃划线热消除。XhoI 酶切验证（图 2-4）和测序检验 srfC 基因敲除成功，敲除菌株命名为 BS1。转化 pHYcas9dsrf1 后有 66 ±14 个转化子，挑取 30 个转化子进证，有 13 ±2 个菌落敲除成功，敲除效率为 43% ±6%，结果表明 CRISPR/Cas9 基辑系统在枯草芽孢杆菌中是一种高效的基因编辑方法。
除核酸电泳验证。M：DL2000 MT：突变型firmation of the frameshift mutatio对菌株 B.subtilisATCC605株 B.subtilisATCC6051a 产 490 μL，而菌株 BS1 产生 h 后两株菌泡沫高度相似， B.subtilisATCC6051a 中 sr产生。菌株 B.subtilisATCCBS1 在发酵 66 h 菌体干重达发酵前 66 h 菌株 B. subtilis菌体的生长可能有一些影响较快一些，可能和其发酵过
【参考文献】
相关期刊论文 前2条
1 余小霞;田健;刘晓青;伍宁丰;;枯草芽孢杆菌表达系统及其启动子研究进展[J];生物技术通报;2015年02期
2 陈乃用;枯草芽孢杆菌中质粒的稳定性问题[J];微生物学通报;1993年04期
相关博士学位论文 前1条
1 邹纯;重组Bacillus deramificans普鲁兰酶的高效胞外表达及其应用[D];江南大学;2016年
相关硕士学位论文 前2条
1 宋皖;长野芽孢杆菌普鲁兰酶基因在枯草芽孢杆菌中的重组表达及条件优化[D];江南大学;2016年
2 王兵波;一种普鲁兰酶嵌合体及其在毕赤酵母中的高效表达[D];江南大学;2016年
本文编号：2790441
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/hxgylw/2790441.html
最近更新
教材专著
