液态发酵生产茶褐素及其生物活性研究

发布时间：2020-08-20 11:23

【摘要】：茶褐素(TBs)是一类锈褐色且具有酚类性质的结构复杂的高聚物,具有降血糖、降脂减肥等多种生物活性,对骨肉瘤和肺癌表现良好的抗癌作用,但对一些常见多发癌症(如乳腺癌等)的研究尚未见报道。茶褐素在普洱熟茶中含量较高,而普洱茶发酵周期较长,导致茶褐素生产效率低,限制了茶褐素资源的开发利用。因此,寻找高效生产茶褐素的方式并全面了解其生物活性成为研究热点。本文筛选了产茶褐素的优势菌,并优化其液态发酵工艺,显著提高了茶褐素生产效率,并对液态发酵生产的茶褐素的化学组成及生物活性进行了分析,旨在为开发具有良好抑菌、抗氧化和抗乳腺癌生物活性的茶褐素相关功能性食品提供实验依据。取得的主要研究结果如下:(1)产茶褐素优势菌的筛选鉴定及液态发酵工艺优化。通过筛选获得3株高产茶褐素优势菌,分别为杰丁毕赤酵母、黑曲霉、烟曲霉,并优化了优势菌高效生产茶褐素的液态发酵条件,即发酵温度37℃、摇床转速180 rpm,当发酵时间为5 d时,茶褐素TBs_(黑曲霉)、TBs_(烟曲霉)和TBs_(杰丁毕赤酵母)的含量分别达到16.29%、27.11%和9.29%,其中,茶褐素TBs_(黑曲霉)和TBs_(烟曲霉)的含量大大超过了传统渥堆发酵的水平,且较渥堆发酵时间显著缩短。(2)优势菌液态发酵茶褐素的化学组成比较分析。与传统渥堆态发酵所得的茶褐素相比,优势菌液态发酵所得的茶褐素中总酚含量明显较高(P0.05),而总糖、蛋白质含量因菌株不同而有所差异。紫外可见光谱和红外光谱分析发现,液态发酵与渥堆发酵茶褐素具有相似的官能团,且均为多羟基酚类物质。(3)液态发酵茶褐素的生物活性评价。(1)最小抑菌浓度实验分析发现,在0.5~8mg/mL的浓度范围内,TBs_(杰丁毕赤酵母)对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的抑菌能力强于TBs_(烟曲霉)和TBs_(黑曲霉)。(2)体外抗氧化实验测定茶褐素的还原力和DPPH自由基清除能力,发现液态发酵茶褐素均具有抗氧化活性,且存在浓度依赖效应,当浓度为0.5 mg/mL时,还原力大小顺序为TBs_(杰丁毕赤酵母)TBs_(烟曲霉)TBs_(黑曲霉),在10~60μg/mL范围内,TBs_(杰丁毕赤酵母)对DPPH自由基的清除能力显著高于TBs_(烟曲霉)和TBs_(黑曲霉)(P0.05)。(3)进一步研究液态发酵茶褐素对乳腺癌细胞MDA-MB-231的影响,结果发现,TBs_(烟曲霉)、TBs_(杰丁毕赤酵母)和TBs_(黑曲霉)均对乳腺癌细胞增殖有抑制作用,且呈时间和剂量依赖效应,其中,TBs_(黑曲霉)对乳腺癌细胞的增殖抑制效果最强。进一步通过细胞形态观察、DAPI核染色和线粒体膜电位检测TBs_(黑曲霉)对乳腺癌细胞凋亡的影响,发现TBs_(黑曲霉)是通过诱导线粒体膜电位降低,进而导致细胞凋亡线粒体通路的发生。实验结果表明,不同优势菌液态发酵生产的茶褐素具有不同的生物活性,因此,可针对不同的应用需求进行相应的茶褐素液态发酵生产和功能食品开发。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ920.1;TS218
【图文】：

黑色沉淀,不溶性,化学组成

华中科技大学硕士学位论文随着酸性增强而降低。董文明等[11]对普洱茶茶褐素进行甲醇-水梯度分离、薄层色谱以及膜透析技术处理，分离纯化出两种物质，进一步采用红外光谱、高效液相色谱、核磁共振和 GC-MS等结构分析方法进行鉴定，结果发现，化合物 I 为多羟基酚类高分子物质，化合物II 可能为磷酸甘酯钠。谭超等[5]利用膜透析技术对茶褐素大小分级，通过原子力显微技术对不同分子量的茶褐素观察，发现粒子形貌并不均一，进一步对其酸水解，对去除多糖和蛋白后的黑色沉淀物质进行 CP-GC/MS 分析，鉴定出可能存在的化合物类型（图 1-1），其中，黑色沉淀物质中氟是如何与大分子色素结合还需进一步研究。

茶多酚,菌株,渥堆,平板划线

华中科技大学硕士学位论文株，进行多次平板划线纯化，将纯化得到的菌株标号为 sc1~9，分别接种至液体培养基中进行摇瓶发酵。根据目前研究进展，形成茶褐素的前体物质主要是茶类物质，在渥堆发酵过程中茶多酚含量逐渐下降，并主要转化成茶褐素。因此茶多酚含量为依据进行初筛，测定各发酵液中茶多酚含量，结果如图 2-1 所示。

菌落形态,微生物,菌落,实验组

图 2-2 不同微生物对茶褐素含量的影响Fig.2-2 Effects of different microorganis on concentrations of theabrownins 为不接种微生物对照组，sc3、sc5、sc6、sc7、sc8 和 sc9 为实验组。星号表示实验组相比于 CK显著性差异（P < 0.05），n = 3。产茶褐素优势菌株的鉴定1 菌株形态学观察1）将菌株 sc5 接种至 PDA 固体平板上，28℃培养 4 天，观察菌落形态2-3 所示。PDA 平板上菌株 sc5 菌落呈圆形，边缘整齐，菌落乳白色，滑湿润。进一步利用显微镜观察，发现细胞呈椭圆形，以多边出芽方殖。根据形态学特征初步推断 sc5 为酵母菌。

【参考文献】