微生物谷氨酰胺转氨酶的发酵与异源表达研究

发布时间：2020-08-20 18:06

【摘要】：微生物源谷氨酰胺转氨酶(Microbial Transglutaminase,MTG)在农产品加工产业中是一种非常重要的酶制剂,广泛应用于乳品、海鲜、肉类、面点、豆制品、可食用膜等多种产品的加工生产中。目前,MTG来源于天然菌种的发酵或MTG基因在细菌、酵母菌中的重组表达。天然菌株发酵可以直接获得有活性的酶,但是发酵周期长且工艺流程复杂;重组菌株发酵周期短、成分简单,但活性表达需要选择适合的表达策略,否则容易形成包涵体或无法获得有活性产物。为了解决以上问题,本研究以实验室前期筛选得到的两株具有MTG活性的放线菌菌株107.3和109.5为研究对象,从菌种选育、下游处理条件摸索、异源表达机制探索、酶分子改造及特性表征等几方面着手,获得主要研究结果如下:MTG产生菌的系统发育研究。经过16S rDNA序列测定和系统发育树的构建以及形态观察,确定菌株107.3为吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)近似种,吸水链霉菌是链霉菌属中目前已知的MTG高产菌种之一;菌株109.5为嗜角蛋白拟无枝酸菌(Amycolatopsis keratinophila)的近似种,其MTG活性尚未见报道。菌株109.5的诱变育种以及MTG的浓缩初提。确定了菌株109.5的最适种子培养基为葡萄糖10.0 g/L,蛋白胨10.0 g/L,酵母粉10.0 g/L,MgSO_4·7H_2O 0.5 g/L,K_2HPO_4 0.7 g/L,KH_2PO_4 0.3 g/L,pH7.0;发酵条件为30℃,200 r/min种子培养30h后,以0.5%接种量转接发酵培养基,发酵70 h。先后采用紫外线诱变、羟胺诱变和多功能等离子体诱变系统(MPMS,multifunctional plasma mutagenesis system)对菌株109.5进行了诱变,并通过正交试验优化发酵培养基为葡萄糖25 g/L,蛋白胨35 g/L,酵母粉1 g/L,NaCl 2 g/L,pH 7.2;使突变株PM-66的酶活力达到1.421±0.009 U/mL,比野生型菌株提高了3.55倍。建立了基于Image J图像灰度分析的固体培养基半定量筛选突变株的方法,实现了突变株的高通量筛选,也为其它同样不便于进行液体比色的菌株筛选提供了新思路。采用双水相萃取(ATPE,aqueous two phase extracton)的方法对突变株PM-66发酵液中的MTG进行了浓缩初提,确定了最适双水相系统ATPS(aqueous two phase system)为26%PEG1000-19%(NH_4)_2SO_4-5%NaCl,萃取体系pH值为6.0,萃取的产率为86.51%,比酶活0.83U/mg,萃取后向PEG相中添加9%的(NH_4)_2SO_4可以获得酶的沉淀。将双水相萃取法应用于拟无枝酸菌发酵液MTG的初提尚未见报道。菌株107.3的MTG基因克隆表达与分子改造。首先,菌株107.3 MTG基因被克隆并转化到了大肠杆菌(Escherichia coli)中,在IPTG(异丙基硫代半乳糖苷,isopropylβ-D-thiogalactoside)的诱导下,重组大肠杆菌的酶活力为0.372±0.008U/mL;镍离子亲和层析纯化后,重组MTG最适温度35℃,最适pH7;Na~+、K~+对酶活有少许促进作用,Zn~(2+)、Cu~(2+)、Mg~(2+)、Fe~(2+)、Mn~(2+)则对酶活有不同程度的抑制作用,Ca~(2+)对酶活几乎没有影响。其次,构建并成功表达了14种菌株107.3 MTG的不同形式突变体,多数突变体的的催化活性或稳定性优于未突变酶,Y133F突变体的比活力最高;在Y133位点进一步构建并表达了8种氨基酸替换突变体,其中6种突变体的比活力都高于未突变酶。由此说明酶分子改造的有益突变位点主要集中于分子N端和靠近酶活性裂缝的周围区域;Y133是吸水链霉菌MTG分子中的有益突变位点。最后,为了研究MTG前导片段的功能,吸水链霉菌MTG基因与茂源链霉菌(Streptomyces mobaraense)MTG基因分别被转化到毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株X33中,采用了前导片段与成熟酶分开或融合两种表达形式。表达融合吸水链霉菌MTG前导片段与成熟酶的重组酵母菌株6711在1.5%甲醇诱导下,30℃发酵96 h,酶活力为0.200±0.005 U/mL。单独表达前导片段与成熟酶的重组菌株均未检测到酶活。说明前导片段与成熟酶分别表达不能使成熟酶进行正确的折叠,只有在正确切割的前提下,前导片段才可以帮助成熟酶折叠为正确的空间结构,表现出活性。
【学位授予单位】：河北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ925;Q78
【图文】：

残基,氨酰,酰基,受体

微生物谷氨酰胺转氨酶的发酵与异源表达研究1 引言酶氨酶的微生物酶（ EC 2.3.2.13 ； Transglutaminase ； Protein氨酰胺肽:胺 γ-谷氨酰转移酶），也称谷氨酰胺转），负责催化多肽和蛋白质中谷氨酰胺残基的 γ-氨甲；当赖氨酸残基的 ε-氨基为酰基受体时，分子内或当水为酰基受体时，谷氨酰胺残基会脱去酰胺基成为①

结构图,链霉菌,结构图

微生物谷氨酰胺转氨酶的发酵与异源表达研究赤酵母[108]pro 与 MTG 插入 Kex2 酶识别位点可溶 Kex2 酶切 0.270假丝酵母[108]α 因子分别与 pro和 MTG融合表达可溶无需 0.338赤酵母[109]α 因子分别与 pro和 MTG融合表达可溶无需 0.180耶氏酵母[110]pro 与 MTG 插入宿主 Kex2 酶识别位点可溶无需 5.260共表达 pro-MTG与蛋白酶 TAMEP 可溶无需 6.770——，文献未报道。Not reported. MTG 分子改造策略了选择合适的异源宿主菌株以及进一步研究宿主中 MTG的表达机制，对 MTG进行各种造，也是提升酶的催化活性或热稳定性的一条重要途径。产自茂源链霉菌的 MTG的基本图 1-2所示[111]。

菌落形态,菌落形态,放线菌,菌落

微生物谷氨酰胺转氨酶的发酵与异源表达研究果与讨论两株放线菌的形态特征线菌菌株 107.3 与 109.5 在高氏培养基上均为白色菌落，菌落表面干燥呈粉末状，刮取。图 2-1 为高氏培养基上生长 3 d 的菌落图片，菌株 107.3 菌落厚且凸起，间可见龟裂，或有细小水滴；菌株 109.5菌落薄而扁平，边缘呈细小绒毛状。在液体培养 2 d 后（图 2-2），两菌株在显微镜下均为菌丝体，带或不带分枝，菌株 107交错，菌株 109.5菌丝短，多断裂为菌丝段。

【参考文献】