酵母合成他汀类药物过程中他汀泵蛋白的功能
发布时间：2020-08-20 20:06
【摘要】：心脑血管疾病作为死亡率超过癌症的一类疾病,近几年来广受人们关注。洛伐他汀是从土曲霉中分离得到的一种聚酮类药物,被广泛作为降血脂药物使用。与洛伐他汀相比,辛伐他汀药用价值更高、副作用更小,具有巨大的药用和经济价值。莫纳克林J是洛伐他汀天然生物合成途径中一个重要的中间体,也是辛伐他汀化学半合成的关键中间体。随着合成生物学的发展,已有报道在酵母细胞中异源合成莫纳克林J和洛伐他汀,及在大肠杆菌中转化为辛伐他汀。在底盘宿主中异源表达目标基因,易对宿主造成生长、代谢压力,同时活性化合物的过多积累也会对细胞造成毒性。本课题组前期在毕赤酵母中已实现莫纳克林J和洛伐他汀的异源合成,同时发现了产物异源合成对底盘宿主产生不利影响。本课题主要研究不同来源的真菌他汀泵蛋白对洛伐他汀及莫纳克林J的转运作用,为大规模异源生产他汀类药物分子提供新的参考。首先,本文以文献报道的柑橘青霉MlcE蛋白为参考进行BLAST检索,发现在洛伐他汀的天然生产宿主——野生型土曲霉NIH2624菌株中,存在与MlcE蛋白有69%相似性的假定蛋白,其功能注释为类似于外排泵,本文将其命名为TapA蛋白。同时,我们发现与MlcE蛋白相似性较高的还有两种他汀泵蛋白,分别为Lovl蛋白和MokI蛋白。本文比较了各泵蛋白的氨基酸序列差异,推测出其保守功能域,并在毕赤酵母表达系统中比较了四种他汀泵蛋白在洛伐他汀耐受和莫纳克林J转运方面发挥的功能差异。其次,以他汀泵蛋白TapA为研究对象,从不同角度分析TapA蛋白对于洛伐他汀的转运功能。亚细胞定位显示TapA定位在细胞膜上,有助于蛋白发挥转运功能。野生型酵母GS115菌株耐受洛伐他汀的浓度不高于0.5 mmol/L,而TapA蛋白过表达酵母菌株的洛伐他汀耐受浓度在25 mmol/L以上。通过在洛伐他汀异源合成的酵母菌株中过表达TapA,分别在摇瓶与5 L反应器发酵,发现该蛋白过表达不仅可以缓解洛伐他汀对于细胞的毒性,还可以大幅提升重组菌株的洛伐他汀生产能力。再者,我们发现细胞外的莫纳克林J大约只有2%可以穿过细胞膜进入细胞内,证实了莫纳克林J存在跨膜困难的问题。在异源生产莫纳克林J的酵母菌株中利用PAOXl启动子过表达TapA,以甲醇为碳源,发现摇瓶中莫纳克林J产量提升,而反应器中莫纳克林J产量下降。通过细胞内外莫纳克林J含量检测,发现TapA过表达菌株J#9-TapA的细胞内莫纳克林J比例高达49%,而农过表达TapA菌株J#9的细胞内莫纳克林J含量仅为16%。我们推测,反应器合成MJ的能力高于摇瓶,细胞内外的莫纳克林J浓度差较大,这种势能促使TapA蛋白将细胞外的莫纳克林J转运至细胞内,以维持较小的细胞内外莫纳克林J浓度差,导致细胞内莫纳克林J对细胞的毒性增大,细胞合成莫纳克林J能力减弱。最后,我们在高产莫纳克林J的酵母菌群系统中进一步探索了TapA提升莫纳克林J生产能力的潜力。首先,利用高水平葡萄糖阻遏/低水平葡萄糖诱导型启动子PHXTl控制脂肪酸合酶基因的表达调控,以乙醇为碳源高效提升产物的合成能力,实现反应器发酵中莫纳克林J产量提高了45%。以此为基础,在菌群系统的下游菌株中过表达蛋白TapA,发现不同强度的启动子表达TapA时效果存在明显差异,与未过表达TapA蛋白的菌群相比,过表达TapA蛋白的菌群在摇瓶培养时莫纳克林J产量在9%～140%范围波动。相比之下,表达TapA蛋白的启动子强度越强,菌群的莫纳克林J产量越高。反应器发酵时,莫纳克林J产量最高为1.4g/L,过表达TapA后莫纳克林J产量不升反降,我们推测,这是因细胞内外莫纳克林J浓度差增大,势能促使TapA发挥转运功能导致。此外,我们还研究了TapA与中间产物二氢莫纳克林L之间的关系,由于碳骨架差异较大,TapA对二氢莫纳克林L基本没有转运功能。本研究表明四种他汀泵蛋白在毕赤酵母表达系统中对莫纳克林J和洛伐他汀均可以发挥转运功能,并在一定程度上缓解异源表达菌株的生长代谢压力,提升菌株合成他汀类化合物的能力,为合成辛伐他汀等其他药用价值更高的化合物提供了新思路。
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ464
【图文】：
ＬＤＫＳ）Ｉ｜４Ｉ。ＬＮＫＳ埅因的表征对ｒ？理解＝：试兑纳克林Ｌ和洛伐他汀的碳骨架组装具有重逡逑要意义，ＬＮＫＳ逦的产物＞与ＬｏｖＣ邋（假定的烯酰还原酶湘瓦作用，催化生物合成途径逡逑的第一部分反应，产生二氢莫纳克林Ｌ（图１．２）［｜５１。在洛伐他汀合成途径的最后一步，／ｏｖＦ逡逑表达的ＬＤＫＳ与催化２－甲基丫酸与莫纳克林Ｊ相连接的ｌｏｖＤ邋（醋酶）相互作用［１５１，编码逡逑这些酶和调节因子的基因阐明丫丨：曲霉中洛伐他汀的产生机制。Ａｕｄａｉｒ等【１６１发现ＬＮＫＳ逡逑催化六肽的分子内Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ封闭，形成双环系统，具符与：氢莫纳克林Ｌ相同的环逡逑立体化学。N希荷锨拙曛醒芯柯宸ニ∩锖铣傻模校耍雍蟛街瑁⑾郑蹋铮觯玫鞍椎淖麇义嫌檬侨繁＃蹋铮觯碌皍4正确组装洛伐他汀中的非缺失链，而ＬｏｖＦ蛋白连接甲基丁酸酯侧逡逑链不需要ＬｏｖＣ蛋〔丨，ＬｏｖＣ蛋白在二氢莫纳克林Ｌ的ＰＫＳ后加［：中没有发挥可检测的逡逑功能［｜７１。Ｘｕ等【１８１鉴定出硫酯酶ＬｏｖＧ负贵从ＬｏｖＢ中释放产物，还可以清除ＬｏｖＢ屮的逡逑中间体。总之，洛伐他汀基因簇的研[偝浞直砻鞴丶锝槌杀嗦氲模陡雒钢苯硬五义嫌肫渖锖铣桑祝祝伞ｅ义希埃遥疲卞澹希遥疲插澹
本文编号：2798384
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ464
【图文】：
ＬＤＫＳ）Ｉ｜４Ｉ。ＬＮＫＳ埅因的表征对ｒ？理解＝：试兑纳克林Ｌ和洛伐他汀的碳骨架组装具有重逡逑要意义，ＬＮＫＳ逦的产物＞与ＬｏｖＣ邋（假定的烯酰还原酶湘瓦作用，催化生物合成途径逡逑的第一部分反应，产生二氢莫纳克林Ｌ（图１．２）［｜５１。在洛伐他汀合成途径的最后一步，／ｏｖＦ逡逑表达的ＬＤＫＳ与催化２－甲基丫酸与莫纳克林Ｊ相连接的ｌｏｖＤ邋（醋酶）相互作用［１５１，编码逡逑这些酶和调节因子的基因阐明丫丨：曲霉中洛伐他汀的产生机制。Ａｕｄａｉｒ等【１６１发现ＬＮＫＳ逡逑催化六肽的分子内Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ封闭，形成双环系统，具符与：氢莫纳克林Ｌ相同的环逡逑立体化学。N希荷锨拙曛醒芯柯宸ニ∩锖铣傻模校耍雍蟛街瑁⑾郑蹋铮觯玫鞍椎淖麇义嫌檬侨繁＃蹋铮觯碌皍4正确组装洛伐他汀中的非缺失链，而ＬｏｖＦ蛋白连接甲基丁酸酯侧逡逑链不需要ＬｏｖＣ蛋〔丨，ＬｏｖＣ蛋白在二氢莫纳克林Ｌ的ＰＫＳ后加［：中没有发挥可检测的逡逑功能［｜７１。Ｘｕ等【１８１鉴定出硫酯酶ＬｏｖＧ负贵从ＬｏｖＢ中释放产物，还可以清除ＬｏｖＢ屮的逡逑中间体。总之，洛伐他汀基因簇的研[偝浞直砻鞴丶锝槌杀嗦氲模陡雒钢苯硬五义嫌肫渖锖铣桑祝祝伞ｅ义希埃遥疲卞澹希遥疲插澹
本文编号：2798384
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