放射型根瘤菌产环β-1,2-葡聚糖的合成过程优化

发布时间：2020-08-27 13:32

【摘要】：环β-1,2-葡聚糖是以葡萄糖为单体,经β-1,2-糖苷键连接的聚合度位于17~40之间的具有较强水溶性的环形多糖。环β-1,2-葡聚糖在植物根瘤形成、布鲁氏菌免疫逃逸等过程中起着重要作用。获得足量的环β-1,2-葡聚糖是分析其详细功能及作用机制的基础。但是目前尚没有大量获得环β-1,2-葡聚糖的有效方法与途径。针对该问题,本文以生物安全菌株放射型根瘤菌(Rhizobium radiobacter ATCC 1333)为研究对象,通过优化发酵培养基、条件和发酵工艺,探索强化环β-1,2-葡聚糖合成的策略,对发酵液中的多糖进行分离纯化和结构解析,并对NaNO_3强化环葡聚糖合成与分泌的发酵工艺与分子机制进行了初探,主要研究如下:(1)优化发酵法合成胞外环葡聚糖产量,首先对8种氮源和6种碳源进行初选,并对培养基成分进行单因素优化;然后设计Plackett-Burman试验,筛选出显著影响胞外环葡聚糖产量的因素;最后采用四因素五水平的响应面优化法实现胞外环葡聚糖产量的最大化。优化得到最佳发酵条件为:甘露醇23.0 g·L~(-1)、谷氨酸3.5 g·L~(-1)、NaCl 0.2 g·L~(-1)、温度32℃,该条件下胞外环葡聚糖产量为1.78 g·L~(-1),与优化前相比,胞外环葡聚糖产量提高了206.9%。(2)针对高浓度谷氨酸使发酵液颜色发生褐化、造成细胞浓度无法提高,进而影响环葡聚糖合成的问题,提出pH调控策略。在7 L反应器的基础上建立通过调控pH结合谷氨酸补料抑制褐变的发生来提高细胞浓度的发酵控制策略。并提出pH两阶段控制策略,生长期将pH控制在7.0,产糖期控制pH为5.5,同时间歇补充氮源,从而成功抑制了发酵液褐化的现象,并将细胞浓度提高到6.36 g·L~(-1),环葡聚糖浓度提高到2.79g·L~(-1);另外结合溶氧控制策略,进一步将细胞浓度增加至8.94 g·L~(-1),环葡聚糖产量达到2.94 g·L~(-1),菌体的生产强度为0.34 g·g~(-1),较优化前细胞浓度提高了138.3%,环葡聚糖的产量提高了61.5%。(3)确定发酵液中多糖组分的精细结构。对经pH调控后的发酵多糖产物进行提取纯化,结合乙醇分级沉淀、固相萃取法以及高效液相法进行纯化制备,利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱、单糖组成分析、电喷雾串联质谱、傅里叶红外光谱和核磁共振手段对发酵部分多糖进行结构解析,确定这部分多糖主要有两个组分:组分Ⅰ是酸性多糖,由七个葡萄糖和一个半乳糖组成,含有丙酮酸和琥珀酸取代基;组分Ⅱ是以葡萄糖为单体,通过β-1,2-糖苷键连接的环葡聚糖,聚合度分布为17~22,主要以19个聚合度为主,无支链结构。(4)发现NaNO_3作为氮源有利于环葡聚糖的胞外分泌,并在此基础上提出谷氨酸-NaNO_3补料策略,使得环葡聚糖的胞外分泌量大增。然后利用双向电泳技术对两种氮源发酵的菌体中胞内蛋白进行差异分析,主要差异蛋白涉及无机离子的转运和代谢、胞外多糖合成、能量代谢以及氧化还原等功能,且ABC转运系统对环葡聚糖的合成以及胞外分泌有着至关重要的作用。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ929
【图文】：

级沉淀组分的薄层层析验证以及 MALDI-TOF MS 验证(a：TLC 验证图沉淀 2；b：沉淀 1 的 MALDI-TOF MS 图；c：沉淀 2 的 MALDI-TOF M6 The verification of fermentation fractionated precipitation components by phy and MALDI-TOF MS ( a is the TLC graph, 1 is precipitate 1, 2 is precipMALDI-TOF MS of precipitated 1; c is the MALDI MS of precipitated 2) 法分离沉淀 2PLC 法对多糖组分沉淀 2 进行检测分析，分析方法如 2.4.3。主-17a)，并对各个峰收集，进行 TLC 验证(图 3-17b)。图 3-17 HPLC 的谱图(a)以及各峰组分的 TLC 验证(b)

级沉淀组分的薄层层析验证以及 MALDI-TOF MS 验证(a：TLC 验证图沉淀 2；b：沉淀 1 的 MALDI-TOF MS 图；c：沉淀 2 的 MALDI-TOF M6 The verification of fermentation fractionated precipitation components by phy and MALDI-TOF MS ( a is the TLC graph, 1 is precipitate 1, 2 is precipMALDI-TOF MS of precipitated 1; c is the MALDI MS of precipitated 2) 法分离沉淀 2PLC 法对多糖组分沉淀 2 进行检测分析，分析方法如 2.4.3。主-17a)，并对各个峰收集，进行 TLC 验证(图 3-17b)。

b：沉淀 1 的 MALDI-TOF MS 图；c：沉淀 2 的 MALDrification of fermentation fractionated precipitation compoMALDI-TOF MS ( a is the TLC graph, 1 is precipitate 1, 2I-TOF MS of precipitated 1; c is the MALDI MS of precip沉淀 2对多糖组分沉淀 2 进行检测分析，分析方法如 并对各个峰收集，进行 TLC 验证(图 3-17b)。图 3-17 HPLC 的谱图(a)以及各峰组分的 TLC 验证(b)17 HPLC chromatograms (a) and TLC verification of each

【参考文献】

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本文编号：2806170