球拟假丝酵母产槐糖脂的发酵条件优化及工程菌株的构建

发布时间：2020-08-28 20:15

　　表面活性剂可以作为提高乳化性、溶解性以及分散性的物质,其应用可以覆盖我们的工业生产如化工产业和我们的日常生活如食品、药物等各个方面。特别地,近年来由微生物产生的生物表面活性剂,由于其优异的表面活性、良好的环境友好性和可降解性而受到持续关注。槐糖脂作为其中一种重要的糖脂类生物表面活性剂而被广泛用于食品行业、日化行业、医药行业以及环境保护等诸多领域。目前,较高的生产成本及较低的产量成为制约槐糖脂生产应用的两个主要因素。因此,降低其生产成本并提高其产量,研究者们开展了大量研究工作。本论文在降低槐糖脂的生产成本方面主要从对其发酵培养基进行优化和对其生产菌株进行遗传改造两方面进行了研究。本论文的主要研究内容及结果如下:1.球拟假丝酵母产槐糖脂的发酵培养基优化微生物的生长和繁殖需要从基质中连续吸收营养物质以获取能量并合成代谢物。为了研究微生物的生长繁殖以及代谢物的合成,首先要了解微生物的营养需求和培养条件,以便有效控制微生物的生长繁殖和产物代谢,达到工业化生产的目的。因此,研究微生物的营养特性和培养条件,进行发酵培养基的有效优化是实现微生物发酵产业化的一个关键因素。发酵培养基的优化路线一般分为两步,首先优先确定主要影响因素,然后通过多因子实验进一步优化培养基各成分的最适浓度。在本论文采用Plackett-Burman设计和中心组合设计对球拟假丝酵母产槐糖脂的发酵培养基进行了有效优化,优化后的槐糖脂产量由53.2 g/L增加到72.2 g/L,产量提高了约38%。2.透明颤菌血红蛋白基因在球拟假丝酵母中的功能研究好氧微生物在发酵的过程中,必须持续不断通入无菌空气,氧气先由气相溶解到液相,再为细胞所吸收,用于菌体生长以及代谢产物的合成。因此,发酵液中的溶解氧水平对细胞的生长和代谢物的合成具有重要的生理作用。目前发酵过程常用的氧控制方法有:(1)提高设备供氧能力,如提高搅拌转速等;(2)增加空气总压,或者是进行富氧通气,从而提高氧分压;(3)控制菌体对氧的消耗速率。这些方法往往对设备要求高,用于槐糖脂的工业化生产中导致成本较高。值得注意的是,目前几乎没有任何关于以基因工程技术对产槐糖脂菌株的摄氧能力进行菌种改良的报道。本论文通过遗传操作将透明颤菌血红蛋白基因vgb整合到球拟假丝酵母基因组中,构建了一株对氧气利用能力大幅提高的重组菌株。在摇瓶发酵实验中,不同的转速条件下(110 rpm,150 rpm,200 rpm),槐糖脂的产量分别提高了 18.4%。,65%,18.2%。在1L发酵罐的发酵实验中,不同转速条件下(400 rpm,600 rpm),槐糖脂的产量分别提高了24%,33%。重组菌株在400 rpm条件下的槐糖脂产量接近于野生型菌株在600 rpm条件下的产量,显示出极好的工业应用前景。3.利用木质纤维素原料产槐糖脂系列工程菌株的构建目前,未能实现槐糖脂大规模工业化的主要原因之一是生产成本较高。发酵过程中需要包括亲水性碳源(葡萄糖)和疏水性碳源(脂肪酸)在内的两种碳源,其中亲水性碳源葡萄糖的用量达到80 g/L。木质纤维素是由约14,000个左右的葡萄糖单元组成的长链β-D-葡萄糖,是自然界中含量最为丰富的一种可再生资源。以纤维素资源取代糖类是目前发酵工业上降低原料成本的一种重要的方式,然而产槐糖脂的球拟假丝菌株不能直接利用纤维素原料,如何使槐糖脂产生酵母能够利用生产质资源直接产生槐糖脂就成一个挑战。在本文中,通过基因工程技术构建了表达草酸青霉的主要纤维素酶基因eg1,eg2,bg1,cbh 的系列球拟假丝酵母重组菌株EG1,EG2,BGL1以及CBH2。为了使各基因协同发挥作用,我们采用了菌株共培养的策略,以1%的磷酸膨胀纤维素为底物进行了发酵实验。结果表明,通过共培养重组菌株降解磷酸膨胀纤维素所产生的槐糖脂总量是野生型菌株的2.6倍,表明该系列重组菌株水解木质纤维生产槐糖脂的优势,初步实现了利用木质纤维素原料生产槐糖脂的设想。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TQ423;TQ920.6
【部分图文】：

产量,变量,方差分析,空心柱

逦Ｓ３９６．Ｓ４逦１５逡逑图２－１邋ＰＢＤ实验结果方差分析逡逑变量影响产量的Ｐａｒｅｔｏ图更加直观地展示了邋ＰＢＤ方差分析的结果，如图２－２所逡逑示，空心柱表示单因素对槐糖脂产量的影响，实心柱则表示各因素之间的交互作逡逑用。由图２－２看出８和０，即７￡３５１６NB加（：１和灿２＾＞0４１２出0对槐糖脂的生产有显逡逑著影响，且各个因素之间没有明显的交互作用。逡逑３邋的逦Ｓｏｎｆｅｒｒｏｒａ邋Ｕｒｏｔ邋３．３６４２２逡逑３．５６邋—逡逑已逡逑３．１６邋—邋ＩＴＴ逡逑２．７７－逦Ｄ逡逑ｒ＝ｒ逡逑２－３７邋—逦ｐ逦ｔ－Ｖ＾ｅ逦Ｕｎｒｔ邋２２Ｓ２＼ｔ逡逑１．９８邋一逦＂逡逑１．５８邋—逦一￣｜逦ｒ逡逑ｎ邋ｎ邋ｎ逡逑１．１９邋—逦｜逡逑ＥＵｕｕｌｌｌｙｉｎｎｉｉｉ＞．逡逑ｉ逦ｉ逦ｉ逦ｉ逦ｉ逦ｉ逦ｉ逦ｉ逦ｉ逦ｉ逦ｉ逦ｉ逦ｉ逦ｉ逦ｉ逡逑１逦２逦３逦４逦５逦６逦７逦８逦９逦１０逦１１逦１２逦１３逦１４逦１５逡逑图２－２变量影响槐糖脂产量的Ｐａｒｅｔｏ图逡逑１８逡逑

产量分布,产量,中心组合,假丝酵母

２．２．２两因素五水平中心组合实验逡逑通过两因素五水平的中心组合实验确定显著影响因素的最优水平，实验设计逡逑及结果见表２－３。五个水平１￣５分别以－ａ，－１，０，邋１，邋ａ来表示，由图２－３所示，逡逑Ｎａ２ＨＰ0４邋１２Ｈ２０在第一个水平（－ａ），ｙｅａｓｔ邋ｅｘｔｒａｃｔ在２？３水平？０）时，槐糖脂产量逡逑较高，结合图２－４的产量３Ｄ直观展示图可以看出，ｙｅａｓｔ邋ｅｘｔｒａｃｔ在第二个水平（－１），逡逑Ｎａ２ＨＰ0４ｌ２Ｈ２0在第一个水平（－ａ）时，槐糖脂产量最高，即ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃ＾２．５ｇ／Ｌ，逡逑Ｎａ２ＨＰ０（１２Ｈ２０取０．１邋ｇ／Ｌ时，槐糖脂的产量最高。逡逑？．ｌｌｒＪｒ１１：．，邋？ｏ－ｉｏ逡逑■邋ｊｏ邋？逡逑Ｘ｜逦７逦３逦４逦５逡逑图２－３邋Ｙｅａｓｔ邋ｅｘｔｒａｃｔ和Ｎａ２ＨＰ0４．１２Ｈ２０对球拟假丝酵母产槐糖脂影响的等值线图逡逑＿＿逡逑图２－４槐糖脂产量分布的３Ｄ展示图逡逑２．２．３发酵验证优化培养基逡逑将球拟假丝酵母分别接种初始发酵培养基（葡萄糖８．０％，油酸６．０％邋（ｖ／ｖ），逡逑酵母粉０．３％，邋ＫＨ２Ｐ0４0．１０％，Ｎａ２ＨＰ0４．１２Ｈ２Ｏ０．１％，ＭｇＳ０４．７Ｈ２0０．０５％（ｗ／ｖ））逡逑和优化后的培养基（葡萄糖８．０％

等值线图,假丝酵母,等值线图,产量

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