抗牙周炎致病菌复合型卵黄抗体的制备及活性研究

发布时间：2020-08-28 20:52

　　 慢性牙周炎是一种常见的慢性牙周疾病,而侵袭性牙周炎不同于慢性牙周炎,是一种快速急性发展的牙周疾病。虽然牙周炎并不致命,但可能会引起刷牙出血、牙齿松动、牙齿移位和口腔异味等现象,影响患者的生活质量。目前主流的治疗方法是基础治疗和抗生素联合使用,但抗生素滥用导致耐药菌株的出现已经成为一个全球性的问题,一旦停止用药,致病菌会重新定植在口腔。近年来,卵黄抗体广泛应用于预防和治疗由细菌、病毒或真菌等微生物引起的疾病。本文制备一种同时抗牙龈卟啉单胞菌和伴放线聚集杆菌的卵黄抗体,评价其生物活性,制作成为合适的剂型,为防治牙周疾病探索新方法。血平板琼脂培养基上观察牙龈卟啉单胞菌和伴放线聚集杆菌的菌落特征,用革兰氏染色、扫描电镜和透射电镜观察细菌形态特征。用二株牙周炎致病菌免疫产蛋母鸡,收集鸡蛋蛋黄液,通过水稀释法或聚乙二醇6000沉淀法提取卵黄抗体,使用硫酸铵盐析或硫酸钠盐析提纯卵黄抗体。提取物中蛋白质的含量用考马斯亮蓝染色法检测,卵黄抗体的相对分子量和纯度使用SDS-PAGE分析,采用ELISA检测卵黄抗体的效价和交叉反应,间接免疫荧光和蛋白质免疫印迹实验分析卵黄抗体的特异性,结晶紫染色定量法检测特异性卵黄抗体对牙龈卟啉单胞菌和伴放线聚集杆菌生物被膜形成的抑制作用。通过免疫电镜和共凝集实验分析卵黄抗体可能的作用机制。最后探讨卵黄抗体在漱口水中的稳定性。结果表明细菌的菌落特征和形态符合报道。水提取或聚乙二醇提取卵黄抗体的方法可行,其中聚乙二醇提取法提取的复合型卵黄抗体效价高,对牙龈卟啉单胞菌的效价峰值为1:10240,对伴放线聚集杆菌的效价峰值为1:5120,在初次免疫后的48天达到效价峰值,持续15天,与14株其他种属细菌的交叉反应性较弱。间接免疫荧光和免疫印迹实验表明,卵黄抗体与抗原的结合具有较高的特异性。卵黄抗体以剂量依赖性的方式抑制细菌生物被膜的形成(p0.05),免疫电镜和共凝集实验表明卵黄抗体可特异性结合并作用于细菌细胞壁,使产生共凝集现象。稳定性评价结果表明,卵黄抗体具有优良的稳定性,能够较好的在漱口水中保持活性。本文制备一种高效价、高纯度、高特异性的复合型卵黄抗体,能够显著抑制牙龈卟啉单胞菌和伴放线聚集杆菌形成生物被膜。研究成果为治疗牙周疾病寻找新的思路,也为卵黄抗体应用于日化产品中提供参考。
【学位单位】：广东工业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TQ464
【部分图文】：

图 1-1 IgY 和 IgG 的结构图Fig. 1-1 Molecular structure of IgY and IgG的生物学特性 至 9， 60℃以下的温度较稳定，抗胰蛋白酶和糜蛋白酶冷冻干燥或喷雾干燥既能够保持活性又有利于其长期储存添加一定的物质均能提高其稳定性。如在 pH 为 3 时，溶液性几乎不受损。

1.5 本文的研究意义及主要工作本研究的目的是制备抗牙龈卟啉单胞菌和伴放线聚杆菌的复合型 IgY，为 IgY 应用于治疗牙周疾病提供实验和理论依据，也为 IgY 应用于日化用品中提供参考。本研究工作主要包括下面几个部分：培养牙周炎致病菌 Pg 和 Aa，将二种细菌相混合，免疫产蛋母鸡，获得复合型 IgY，分离提纯获得高纯度的 IgY。体外测特异性 IgY 的生物活性，包括 ELISA，抑制细菌生物被膜实验，间接免疫荧光等。通过共凝集实验和免疫电镜实验分析 IgY 的作用机制。体外研究 IgY 的稳定性，并将其与现有的漱口水液混合，探究其应用于产品中的可能性，通过 ELISA 实验来研究其在漱口水中的稳定性。本研究整体思路如下图 1-2 所示：

37 ℃、5 %二氧化碳条件下进行培养。Aa 的固体培养则继续用接种环在血琼脂培养基上或者自制血琼脂平板固体培养基上传代培养。细菌的液体培养为，将固体培养的细菌，在超净工作台上接种到 TSB 液体培养基中，培养 24h 后离心收集。为防止细菌菌种丢失，采用甘油冻存管保存菌种于-80 ℃冰箱中，甘油的最终浓度为 20-25 %。Pg 是严格厌氧细菌，培养比 Aa 复杂。首先是固体培养，固体培养基选血琼脂平板培养基或者自制的含血大豆酪蛋白琼脂培养基，接种完成后放入厌氧袋中，同时快速加入厌氧产气袋和厌氧指示剂并合上厌氧产气袋的开口处，避免漏气，能明显感觉到厌氧产气袋发热的现象，是厌氧袋中的化学物质消耗厌氧产气袋中的氧气，观察厌氧指示剂的颜色，判断厌氧袋中是否处于无氧状态。于生化培养箱 37℃厌氧条件下培养 4 至 7 天。可在血平板成品培养基上观察到特征性黑色菌落。使用厌氧液体培养基培养 Pg，首先制作厌氧液体培养基，如下图 2-1 所示，，本文选用的是自制含特殊营养物质的 TSB 液体培养基。

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本文编号：2808144