油橄榄果渣多酚活性物制备及其生物活性研究

发布时间：2020-09-02 12:45

　　橄榄油由于具有丰富的营养价值和保健功能而受到人们的广泛青睐。目前主要采用压榨油橄榄鲜果和二相离心分离的方式生产橄榄油,在此生产过程中会产生大量果渣废弃物(OTPCP),其中残留有大量的多酚类物质未被加工利用,这不仅造成资源的浪费,而且引起严重的环境污染。本文以OTPCP为研究对象,研究果渣多酚类物质组成、热解特征和提取、富集、与蛋白的结合作用、衍生物制备以及生物活性,为OTPCP的高效开发与综合利用提供基础。(1)油橄榄果渣多酚HPLC特征及其质谱裂解规律研究以OTPCP为原料,经除核后,在固液比为1∶4的条件下,对比直接水提和超声辅助酶解(UAEH)提取工艺发现,直接水提液中固形物含量为11.60 mg/g,总多酚为0.75mg/g;UAEH提取液中固形物含量可达34.55 mg/g,总多酚为1.20 mg/g。采用HPLC-MS研究UAEH提取液中主要多酚的HPLC特征,并推测在正负离子模式下,果渣中主要多酚,如没食子酸、羟基酪醇、酪醇、香草酸、咖啡酸、丁香酸、阿魏酸和橄榄苦苷8种成分的质谱裂解规律。结果发现,负离子模式下没食子酸与咖啡酸的裂解规律类似,主要以失去-COOH为主;丁香酸、阿魏酸和香草酸的裂解途径基本相似,主要与-OH、-COOH和-CH_3有关。正离子模式下多酚的裂解规律与负离子模式明显不同,并且出现大量的质子化、钾化和钠化的裂解碎片离子。(2)油橄榄果渣多酚UAEH提取动力学及其萃取部位特征研究以OTPCP除核后的果渣为原料,通过响应面优化,确定UAEH提取多酚最佳工艺:当溶剂pH为5.75,样品在55℃提取40 min时,总多酚得率达到3.99%±0.81(n=3),且验证实验结果与预测值接近。UAEH提取动力学结果表明,多酚的提取符合动力学模型ln(C_t/C_0)=kt,温度对其提取过程的影响较为明显,并且速率常数随温度的升高而增加,同时UAEH提取多酚过程中活化能更低。另外通过采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇溶剂分级萃取UAEH提取液,筛选高含量多酚萃取部位。结果发现,乙酸乙酯萃取部位中多酚含量最高,可达64.43 mg/g,HPLC-MS表明其中主要多酚类化合物含量依次为羟基酪醇、酪醇、没食子酸、丁香酸、咖啡酸、阿魏酸和香草酸,并且该萃取物也具有良好的抗氧化活性。(3)油橄榄果渣在UAEH提取多酚前后热解特征与多酚变化的相关性研究采用红外吸收光谱(FT-IR)、扫描电镜(SEM)和差示扫描量热(DSC)以及热重(TG)等方法,研究油橄榄果渣在UAEH处理前后样品变化及热解特征。FT-IR、SEM和DSC研究结果表明UAEH会使样品在成分组成和组织结构等方面发生明显改变。在不同升温速率条件下的热重分析结果表明,两种样品的热解均分为三个阶段,尽管它们热重曲线呈现相似的变化趋势,但各阶段的温度间隔与峰值温度有明显不同。Kissinger方法、Kissinger-Akahira-Sunose(KAS)模型和Flynn-Wall-Ozawa(FWO)模型计算结果均表明UAEH工艺会使OTPCP样品在热降解过程的活化能降低。当转化度为0.1~0.9时,KAS与FWO模型展现了类似的动力学参数变化特征,平均活化能分别为201.42 kJ/mol和162.97 kJ/mol。同时Coats Redfern方法计算结果发现F_2(f(α)=(1-α)~2)模型能够更好的解释两种样品在热解过程中可能存在的主要的反应机理。(4)油橄榄果渣多酚树脂富集工艺及其动力学规律在静态吸附条件下考察9种不同树脂对OTPCP中多酚的吸附特征。结果发现,XDA-1和NKA-Ⅱ对多酚类物质具有较好的吸附与解吸性能,其吸附率分别为83.33%、84.68%;以40%、60%和80%乙醇溶液为解吸液,解吸率分别为76.62%和73.70%。吸附动力学与等温模型研究结果表明两种树脂对多酚的吸附过程均符合拟二级动力学模型和Freundlich等温吸附模型,整个吸附过程属于快速吸附,并且以化学吸附为主,可能存在电子转移现象,同时伴随有物理吸附作用。颗粒扩散模型结果指出XDA-1和NKA-Ⅱ树脂对多酚物质的吸附过程较为复杂,主要受边界层扩散和颗粒内部扩散控制。另外XDA-1树脂对OTPCP中多酚类物质的富集结果表明,多酚类物质主要集中于40%和60%乙醇洗脱组分,且都具有良好的抗氧化活性,可作为一种有效的活性部位。(5)油橄榄果渣多酚XDA-1树脂富集产物中化学成分研究利用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇对XDA-1树脂富集产物的有效活性部位进行分级萃取。GC-MS分析结果发现乙酸乙酯萃取物中含有化合物的数量较多。石油醚层主要由多种脂肪酸构成;乙酸乙酯层除不饱和脂肪酸外,还包括有烷烃、烯烃及杂环等,并且检测到4-羟基-苯乙醇、3,4-二羟基苯乙醇和4-羟基-3-甲氧基肉桂酸等多酚类化合物;正丁醇部位则主要包含有酯类和醛类等物质。进一步采用不同色谱分离技术对乙酸乙酯萃取物中化学成分进行分析,经结构鉴定共得14种化合物,主要有苯丙素类、黄酮类和多酚类物质,其中包括从该植物废弃物中首次分离得到的2种化合物(儿茶素与没食子酸乙酯)。(6)油橄榄果渣多酚与牛血清白蛋白的相互作用通过荧光光度法研究酪醇和羟基酪醇与牛血清白蛋白(BSA)相互作用,结果发现,两种反应体系的猝灭速率常数均大于2.0×10~(10) L/(mol·s),对BSA的作用属于静态猝灭;而且结合常数都大于1.0×10~3 L/mol,均含有一个结合位点。另外各体系中能量供体与受体之间发生非辐射能量传递,两种酚类物质与BSA的结合距离均小于7 nm,符合F?rest能量传递理论。热力学参数计算结果表明羟基酪醇和酪醇与BSA之间主要以氢键、范德华力和疏水作用力为主。紫外-可见吸收光谱与同步荧光光谱的研究结果也说明,不同类型猝灭剂与BSA发生作用时会导致相关肽链结构或氨基酸残基微环境发生变化。当有Cu~(2+)、Zn~(2+)和Fe~(3+)介入BSA与多酚化合物的反应时,由于猝灭体系的差异性,猝灭速率常数、结合常数、结合距离和相互作用力会发生相应的变化。(7)油橄榄果渣多酚中酪醇衍生物制备及活性评价由酪醇制备β-酮酯,进一步反应生成二氢嘧啶酮衍生物的过程中,催化剂Yb(OTf)_3用量为0.3 mmol时更有利于目标化合物的产生,反应机理可能与Yb~(3+)优先与反应物形成络合体系有关;在酸性条件下,反应物n(苯甲醛)∶n(脲)∶n(β-酮酯)=1∶1.2∶1.2,温度为90℃,反应时间为3 h更易于Biginelli反应的进行,其反应过程中关键步骤可能是N-酰基亚胺离子与羰基化合物异构体发生的亲核加成反应。此外与酪醇直接酯交换的产物相比,含有苄基制备的酪醇β-酮酯类衍生物对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性具有较好的抑制作用,并且由该类化合物制备的3,4-二氢嘧啶酮衍生物对这两种酶活性的抑制作用明显增加,相比于其它取代基,含氟的该类衍生物对两种酶活性的抑制效果更为显著。
【学位单位】：中国林业科学研究院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TS229
【部分图文】：

技术路线图,油橄榄,果渣,多酚

点立了一种系统高效处理油橄榄果渣并得到多酚的新方法，分析有，并考察了主要多酚的裂解规律和与蛋白的相互作用，为该废弃依据。油橄榄果渣中酪醇引入 3, 4-二氢嘧啶酮衍生物的制备，并评价其开辟了油橄榄果渣特征化合物应用的新途径。路线图

校准曲线,多酚,液相色谱图,对照品

图 2-1 多酚对照品液相色谱图e 2-1 Liquid chromatogram of polyphenols reference su合物的校准线性方程及相关系数等参数如表 2表 2-1 多酚类化合物校准线性方程的相关参数ponding parameters of calibration linear equation of ph校准曲线方程uation of calibration curveR2LOD(ng/g)=2301910X-53935.7981 0.9986 0.050 853466.0459X-16611.7556 0.9992 1.123 526716.3818X-15559.5364 0.9996 1.291

裂解途径,多酚类化合物,负离子,离子

没食子酸的 MS2图谱中准确的展现出了较强的裂解离子峰。m/z 124 的裂解离子峰被发现。如图2-2（a）所示，去质子化的没食子酸在 ESI 离子源的条件下质谱裂解方式相对简单。去质子化的离子 m/z124 是由失去-COOH 部分而产生的。图 2-2（b）显示，去质子化的咖啡酸离子 m/z 179 由于失去一个-COOH 而产生裂解离子 m/z 134。咖啡酸的这种裂解途径与没食子酸是一样的。在图 2-2（c）中，丁香酸的裂解过程中，在前体离子 m/z 197 的MS2图谱中，由于失去侧链羟基而生成的产物离子 m/z181 显示出很高的丰度；类似的，分子离子 m/z 198 在失去一个羧基（45Da）后产生的产物离子也具有很高的丰度，这表明苯环上的-COOH 被裂解；而产物离子 m/z 153 可能会进一步失去一个甲基，所以在m/z 138 处出现丰度相对较低的离子峰。

【参考文献】