木糖代谢在卷枝毛霉脂质积累中的作用机制

发布时间：2020-09-09 11:41

　　木质纤维素是天然的可再生原料,来源广泛、价格低廉,将其作为原料生产脂质可以显著降低生产成本。木质纤维素水解液中含量最高的单糖是葡萄糖,其次是木糖,如何提高木糖利用率是工业化利用木质纤维素的关键问题。卷枝毛霉(Mucor circinelloides)是研究脂质积累机制的模式生物,曾用于生产γ-亚麻酸。分析卷枝毛霉的基因组信息发现,它可能具有木糖异构酶(xylose isomerase,XI)代谢路径,但迄今未见报道。为进一步提升卷枝毛霉作为产脂工业菌株的潜力,本文研究了卷枝毛霉的木糖代谢过程以及木糖代谢对其脂质合成的影响,主要内容如下:对比分析卷枝毛霉菌株CBS 277.49、CBS 108.16和WJ11的生长和脂质积累情况,以木糖或葡萄糖为唯一碳源,结果表明卷枝毛霉通过XI路径代谢木糖,且与葡萄糖代谢相比,木糖代谢对其生长和脂质积累没有影响。以卷枝毛霉CBS 277.49的cDNA为模板,分别克隆得到编码XI的基因xylA和编码木酮糖激酶(xylulosekinase,XK)的基因XKS1,通过同源重组的方法连接到质粒pMAT1552上得到表达载体pMAT1552-xylA和pMAT1552-XKS1。随后将表达载体通过电击转化的方法转入尿嘧啶缺陷的卷枝毛霉菌株p LEU-MU402,得到重组菌株Mc-XI和Mc-XK。pMAT1552也被转入菌株pLEU-MU402,得到重组菌株Mc-1552,作为对照菌株。在单一碳源条件下培养重组菌株Mc-XI和Mc-XK,Mc-1552作为对照。结果表明过表达XI和XK均能显著提高木糖的代谢速率和脂质的产量,对脂肪酸组成没有影响。在脂质积累阶段,菌株Mc-XI和Mc-XK中XI和XK的转录水平和酶活性均高于对照组,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose 6-phosphatedehydrogenase,G6PDH)和6-磷酸葡糖糖酸脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,6PGDH)的活性也显著高于对照组菌株。采用葡萄糖(33 g/L)与木糖(17 g/L)质量比约为2:1的混合碳源培养Mc-1552、Mc-XI和Mc-XK,结果表明过表达XI和XK有助于缓解葡萄糖抑制效应。与Mc-1552相比,重组菌株的木糖代谢速率分别提升了37%和25%,总脂肪含量提高了8%和28%。此外,转录水平和酶活分析发现葡萄糖的存在,在一定程度上抑制了XK的转录,重组菌株的XI和XK酶活均高于对照组,转录水平与酶活性变化的趋势基本相同。构建xylA和XKS1基因的融合表达载体pMAT1552-xylA+XKS1,经电击转化获得融合表达XI和XK的重组菌株Mc-OL。在木糖或混糖为碳源的情况下,Mc-OL与Mc-1552相比能够显著提高木糖代谢速率,但是脂质产量几乎没有增长,这可能是因为融合表达后重组菌株中积累了大量的D-木酮糖五磷酸,造成流向脂质合成的碳流量发生流失;同时重组菌株中XK酶活的提高,会导致胞内的ATP过度消耗,同样不利于脂质积累。
【学位单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：TE667;TQ920.1
【部分图文】：

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依据木质纤维素生产脂质可以实现资源的综合利用，减少原料成本。丝维素为脂质的理想微生物之一，然而它们几乎都是通过 XR/XDH 代谢率不高，因此研究大都采用在丝状真菌中构建 XI 路径的方法在微生物内异源表达 XI 或者 XK，均能有效提高木糖代谢率从而产量。 XI 来源的限制，目前在丝状真菌中实现高活性表达的 XI 很少，而菌细胞内没 XI，研究细胞内 XI 和 XK 之间的相互作用更少。卷枝基因组信息提示，该菌株可能具有 XI 代谢路径。检索卷枝毛霉 CB发现编码 XI 的基因 xylA、编码 XK 的基因 XKS1 和编码 XDH 的基组中。根据基因组信息推测卷枝毛霉 CBS277.49 的木糖代谢路径如糖通过 XI 路径转化为 X5P 进入 PPP 完成后续代谢。由于存在 XD木酮糖在 XDH 的作用下生成木糖醇。

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图 3-1 卷枝毛霉 CBS 277.49（a1 和 b1）、CBS 108.16（a2 和 b2）和 WJ11（a3 和 b3）的生物量、脂肪酸含量及脂肪酸组成Fig.3-1 The biomass, lipid content and fatty acids profile of M. circinelloides CBS 277.49 (a1 and b1CBS 108.16 (a2 and b2), WJ11 (a3 and b3)注：标有不同字母表示具有显著性差异，P<0.05。木糖的利用对使用木质纤维素为原料生产脂质十分重要，然而很多产油真菌不能利用木糖或者通过 XR/XDH 路径以较低的速率代谢木糖。此外，葡萄糖作为微生物生长的一种常见碳源，微生物代谢木糖产生的生物量和脂质产量大多数都低于代谢葡萄糖时的量，且在两种糖共存的情况下，优先代谢葡萄糖用于生长所需。然而，本课题使用的卷枝毛霉在木糖或葡萄糖分别作为碳源时得到的生物量和脂质产量几乎相同，这可能是由于卷枝毛霉内部木糖代谢路径和其他代谢路径的协同影响（图 3-2）。

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图 3-2 卷枝毛霉中的木糖代谢Fig. 3-2 Xylose metabolic in M.circinelloides：X5P，木酮糖-5-磷酸；G3P，甘油醛-3-磷酸；F6P，果糖-6-磷酸；GPI，葡萄糖-6-磷酸异酶；G6P，葡萄糖-6-磷酸；G6PDH，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；6PGL，葡萄糖酸-6-磷酸内酯；GLS，葡萄糖酸-6-磷酸内酯酶；6PG，葡萄糖酸-6-磷酸；6PGDH，6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶Ru5P，核糖-5-磷酸。在卷枝毛霉中，木糖首先被转化为 X5P 然后进入 PPP 的非氧化阶段从而进入。有报道称当木糖为碳源时，通过 PPP 非氧化阶段的碳流量会高于葡萄糖为碳量[55,82]。上调的碳流量会使甘油醛-3-磷酸（glyceraldehyde-3-phosphate，G3P）-6-磷酸（fructose-6-phosphate，F6P）的产量增加，从而增加进入 PPP 氧化阶段途径的 G3P 和 F6P 的量，积累更多的 NADPH 和 ATP 供脂质合成所需。此外碳源时卷枝毛霉发酵产生的乙醇产量低于葡萄糖为碳源时的产量，这也从另一了木糖代谢会比葡萄糖代谢积累更少的代谢副产物。更少的代谢副产物积累也糖对脂质的转化率高于葡萄糖的原因之一。

【参考文献】