酿酒酵母合成番茄红素的途径优化研究

发布时间：2020-09-11 12:09

　　番茄红素(C_(40)H_(56))具有猝灭单线态氧、清除自由基、抑制脂质过氧化等多种生理功能,广泛应用于医疗保健领域。与大多数萜类相似,番茄红素在植物中的含量低,化学合成收率不高。合成生物技术的快速发展已经实现利用微生物宿主生产一些萜类化合物,且有被商业化应用的产品实例。本研究结合基因工程和发酵工程方法,在酿酒酵母中导入外源番茄红素合成模块,经代谢途径和发酵过程优化,实现酿酒酵母中番茄红素的合成,取得以下主要研究结果:通过文献检索和在NCBI数据库中筛选挖掘参与番茄红素合成的关键酶,以来源于欧文氏菌的八氢番茄红素合成酶CrtB和来源于红法夫酵母的八氢番茄红素脱氢酶CrtI在酿酒酵母中验证番茄红素的合成,根据酿酒酵母密码子的偏好性密码子优化后在单拷贝质粒pRS41H中表达,高效液相色谱(HPLC)分析证明在工程酵母中成功合成了番茄红素,产量为0.038 mg/L。从底盘宿主种类、功能基因拷贝数和启动子类型等方面综合性考虑,对番茄红素合成途径与底盘宿主的适配性进行了研究。结果表明,以酿酒酵母CEN.PK2-1C为宿主,采用多拷贝质粒pRS42K为载体,使用组成型启动子控制番茄红素合成途径表达时,番茄红素产量比初始菌株提高了约6倍,达到0.152 mg/L。为了优化番茄红素生物合成工程菌中的前体物供应,以酿酒酵母CEN.PK2-1C为宿主,采用基因组整合的方法过表达来源于大肠杆菌的异戊烯焦磷酸异构酶和来源于嗜酸热硫化叶菌的GGPP合成酶并耦合强化MVA合成途径时,番茄红素合成水平显著提高,其产量比初始菌株提高了约945.6倍,达到23.64 mg/L。工程菌发酵条件优化研究表明,工程酿酒酵母合成番茄红素的最佳条件为:酵母浸出粉10 g/L、蔗糖20 g/L、硫酸铵20 g/L、MgSO_4添加量0.05 g/L、K_2HPO_4·3H_2O添加量0.02 g/L,接种量A_(600)为0.05,装液量为24%,摇床转速200 r·min~(-1)、pH为6,发酵温度28℃。柠檬酸补料批式发酵方式下,番茄红素的产量达到79.42 mg/L,比发酵工艺优化前提高了约3.36倍。上述结果说明通过在酿酒酵母中导入外源番茄红素合成模块,经代谢途径和发酵过程优化,显著提高了番茄红素合成水平。
【学位单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TQ920.1;TQ28
【部分图文】：

番茄红素,生物合成途径

被广泛用于生产番茄红素。合成途径合成代谢与调控一直是生物工程领域研究的热点径中各种产物的共同前体物，异戊烯焦磷酸(IPP)生物体合成 IPP 来源的差异，番茄红素的生物合 2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸盐(MEP)及存在于真种途径[51]。MEP 途径由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸经(DXP)，之后转化成 MEP，再经一系列酶的催二烯焦磷酸(IPP)和二甲基丙烯焦磷酸酯(DMAPP)催化生成乙酰乙酰辅酶 A (Acetoacetyl-CoA)后OA)生成 MVA，之后再经几步催化反应生成 IPP。DMAPP 在法昵基焦磷酸合成酶的催化作用下生基香叶基焦磷酸合成酶、八氢番茄红素合成酶和成番茄红素，这 3 个酶分别由基因 CrtE、crtB 和图 1-2 所示。

标准曲线,标准曲线,番茄红素

番茄红素标准曲线

标准曲线,角鲨烯,标准曲线

图 2-2 角鲨烯标准曲线图 2-3 法昵醇标准曲线Fig. 2-2 Standard curve of squalene Fig. 2-3 Standard curve of farnesol酿酒酵母中角鲨烯、法昵醇等代谢产物使用气相色谱仪进行定性定量分析。所用气相色谱仪是岛津 GC2010，色谱柱为 TG-5MS（Thermo 30 m 0.25 mm 0.25 μm），使用的检测器为 FID 检测器，FID 检测器温度为 300℃，进样方式为分流进样，载气为氮气，进样量 1 μL，分流比为 30:1，进样口温度为 250℃，柱箱程序升温起始温度为 80℃以 20℃/min 的速度升温至温度为 300℃，保持时间为 40 min。每个待测样品平行测定次。

【参考文献】