基于介孔沸石材料新型MALDI基质研究及其在小分子化合物定量分析的应用

发布时间：2020-09-15 20:19

　　基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)作为一种软电离质谱技术被广泛应用于生物大分子和有机物高分子的分析。MALDI-TOF-MS具有高通量、快速,样品处理简单等优点,尤其软电离方式可以很好地保证分子的完整性,使其在小分子化合物的结构鉴定与分析中表现出很大的优势和潜力。由于传统的小分子基质在分析小分子化合物时会在低分子量区域(m/z1000)产生大量的基质加合分子离子峰、碱金属加合峰、以及碎片峰干扰,使MALDI-TOF-MS在定量分析小分子的应用中存在一定的局限性。沸石是一种具有催化性能的介孔材料,其表面具有丰富的布朗氏酸活性位点,同时内部具有规则的介孔结构,被认为是一种具有潜力的MALDI基质材料。传统基质结合介孔材料作为复合基质可以有效解决上述问题。本论文首次将沸石负载CHCA作为新型复合基质,将其应用于MALDI-TOF-MS分析小分子化合物,并建立了实际样品中恩诺沙星的定量分析方法。首先,考察了介孔沸石材料负载CHCA用于MALDI-TOF-MS分析小分子模型肽Substance P和氟喹诺酮类药物等小分子的效果。在相同的质谱条件下,与传统CHCA进行了比较,同时分别考察了ZSM-5沸石的硅铝比(SiO_2/Al_2O_3)以及Beta与ZSM-5沸石的介孔大小对Substance P的检测效果。结果表明,沸石负载CHCA新型复合基质具有抑制碱金属加合离子峰、消除干扰离子峰、简化与改善质谱图、提高测量重复性、提高离子化效率等优点。沸石表面酸性越强,介孔能够充分包裹CHCA分子,则复合基质抑制干扰碎片和提高离子化效率的能力越强。复合基质被成功应用于复杂样品中氟喹诺酮类小分子化合物的分析。其次,进一步考察了Beta沸石材料负载CHCA,应用于MALDI-TOF-MS分析恩诺沙星的效果。实验中,分别制备了质子、钠离子及银离子交换的Beta沸石,并在相同质谱条件下进行了比较研究,考察了不同离子交换的Beta沸石以及CHCA/BetaNa不同混合比例对恩诺沙星检测结果的影响。实验结果表明,使用不同离子交换的Beta沸石作为基质材料,能够实现恩诺沙星的选择性离子化;同时,Beta Na沸石负载CHCA新型复合基质用于恩诺沙星小分子的分析中,具有抑制干扰分子离子峰、提高恩诺沙星质谱峰强度等效果。沸石表面活性位点与恩诺沙星存在一定的相互作用关系,进而影响MALDI-TOF-MS质谱分析的离子化效率。复合基质被成功应用于中兽药样品中非法添加氟喹诺酮类药物的筛查。第三,建立了BetaNa沸石负载CHCA作为新型复合基质用于MALDI-TOF-MS定量分析复杂样品中的恩诺沙星的分析方法。针对牛奶与蛋液两类复杂样品,通过添加同位素内标恩诺沙星-D_5,建立了MALDI-TOF-MS定量分析恩诺沙星小分子的方法。通过对实际样品的前处理方法优化,确定了效果最优的提取剂,简化了溶液净化等前处理步骤。通过在恩诺沙星标准曲线溶液与阳性样品中添加同一浓度的同位素内标,将ENR/ENR-D_5质子化峰强度比带入标准溶液曲线方程校正,计算出对应牛奶或蛋液阳性样品中恩诺沙星的准确含量。在0.5 mg/kg-6.0 mg/kg范围内线性良好,0.75 mg/kg-3.00 mg/kg浓度添加范围内的回收率在92%-101%之间,并使用LC-MS/MS检测方法对测试结果进行了对比验证。
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TQ424.25
【部分图文】：

结构示意图,离子,检测器

中国农业科学院硕士学位论文第一章引言质检测的完整性，并且提出该方法具有快速、准确、高通量等优点，田中耕一等人也因此获得 2002年诺贝尔化学奖，MALDI-TOF-MS 技术对生命科学领域的发展做出了重大的贡献。由于 MALDI 所使用的激光源多为脉冲式光源，易与脉冲质量分析器相匹配，如飞行时间质谱仪(TOF-MS)与傅里叶变换质谱仪（FT-MS）(Sunner et al, 1995)。MALDI-TOF-MS 质谱仪结构如图 1-1 所示，由离子源、质量分析器与检测器三部分组成。离子在离子源产生后，在脉冲电场加速下飞入无场漂移管，并以恒定的速度到达检测器。m/z 越大的离子，飞行的速度越慢，到达检测器的时间越长，其飞行时间的平方 t2与质荷比 m/z 成正比，根据这一原理，可以将不同 m/z的离子按照到达检测器的时间长短进行分离(Jurinke et al, 2004)。MALDI 与 TOF 相结合，原理上而言能够检测的分子量范围不受限制。此外，MALDI-TOF-MS 仪器可以配备“离子镜”，使用电场反射粒子，加长离子飞行路径，从而提高仪器分辨率，如今，商用反射模式的 TOF 仪器分辨率 m /Δm 已经远高于 20000 FWHM（半峰宽，Δm 表示峰值高度 50％处的峰宽）。

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图 1-2 MALDI 源样品离子化过程示意图re1-2 The schematic diagram of sample ionization process by MALDI s 机理发展，MALDI 质谱已成为生命科学领域最重要的分析检测工子化机理仍未被完全了解，主要原因：没有一个机理可以完整al, 2003)。MALDI 离子源作为一种软电离技术，在质谱图中获多电荷离子峰、部分碎片离子峰以及自由基离子峰 (Chen Y.C接受的的 MALDI 电离假设机理是 Karas 及 Hillenkamp 等人提, 2003)。在多光子吸收机理中，基质吸收一个光子进入高能过带电基团基质，因此，可以在 MALDI 质谱中观察到自由基质能预计在 9eV~10eV 之间，而 N2激光器产生的 2 个光子能量只完全捕获，因此，无法将全部的基质激发电离。样品离子化瞬离子继续衍生，致使 MALDI 质谱图中产生少量碎片离子峰。紫外激光器提供的单光子能量低 1 到 2 个数量级，所以，这种离子化机理(Karas et al, 1987)。根据这一假设，基质分子吸收

酸位,布朗,沸石,表面

论文品前处理简单等优点，若能开发出准确的定量方法。具有介孔结构的硅铝酸盐材料，被广泛用作工业催M/n2O Al2O3 xSiO2 yH2O （1-6）子；n：金属离子的氧化数；x：SiO2的分子数；y晶置换，具有电负性的 Si-O-Al 键，需要被 H+、N电中性，如图 1-3 所示。由于这些阳离子的活性较生离子交换，被离子交换后的沸石具有不同的酸性石还具有吸附分离性、热稳定性、导电性、催化性等

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