由RNAi介导的CAS基因沉默对珠子参皂苷合成的影响

发布时间：2020-09-18 19:45

　　珠子参[Panax japonicus]为五加科人参属植物,是我国名贵常用中药材,具有祛瘀生新、消炎镇痛、抗肿瘤、免疫调节和止血等多种功效。珠子参皂苷为珠子参的主要活性成分,包括达玛烷型和齐墩果烷型皂苷。目前,珠子参药材多为野生品,其生长周期长,一般生长6年以上方能入药。随着市场需求的不断增长,导致珠子参供不应求的现状。对于高价值、低产量的天然药物,为解决药材资源问题,有必要运用现代分子生物学及基因工程技术对珠子参皂苷的生物合成途径进行探究,进而开展珠子参皂苷的合成生物学研究。珠子参三萜皂苷是珠子参的主要活性成分,与只含有达玛烷型皂苷的同属药材“三七”相比,珠子参中不仅具有达玛烷型皂苷,还含有三七中没有的齐墩果烷型皂苷,因此珠子参的临床用途与三七明显不同。珠子参皂苷主要由甲羟戊酸(MVA)途径合成,在该途径中,达玛烯二醇合成酶(DS)是达玛烷型皂苷合成支路的关键酶,β-香树脂醇合成酶(β-AS)是齐墩果烷型皂苷合成支路的关键酶,而2,3-氧化鲨烯为DS和β-AS的共同前体物质。同时,2,3-氧化鲨烯也是珠子参皂苷合成途径中副产物植物甾醇合成支路的前体物质,它经过环阿屯醇合成酶(CAS)的催化生成环阿屯醇,并经一系列酶反应过程合成植物甾醇。因此,环阿屯醇合成酶与珠子参皂苷合成途径中的关键酶DS和β-AS之间存在竞争性消耗2,3-氧化鲨烯的关系。本研究采用RNAi技术使珠子参CAS基因(PjCAS)表达下调,弱化植物甾醇的合成,使代谢流可以更多的流向三萜皂苷合成途径,最终实现提高珠子参皂苷生物合成的目的。本论文通过反转录PCR将提取的珠子参总RNA反转录成cDNA,并以此为模板扩增出PjCAS基因RNAi片段,之后设计带有attB位点的引物进行PCR扩增,得到两端带有attB重组位点的RNAi片段。随后,利用Gateway~(TM)技术将带有attB位点的RNAi片段通过BP反应以同源重组的方式克隆到双元表达载体pHellsgate 2上,完成RNAi表达载体pHellsgate-CAS的构建。采用冻融法,将成功构建的重组载体pHellsgate-CAS导入农杆菌EHA105,通过根癌农杆菌的介导,将外源基因成功导入并整合到珠子参基因组DNA中,经含卡那霉素培养基和抗性基因PCR筛选,获得6株PjCAS基因的RNAi转基因阳性珠子参细胞系。荧光定量PCR检测发现,与普通珠子参细胞系(WT)相比,PjCAS RNAi细胞中,PjCAS基因的表达量明显下调,证明RNAi细胞系成功构建。为了明确PjCAS基因在珠子参皂苷生物合成途径中的作用,对6株转基因阳性细胞系进行珠子参总皂苷以及植物甾醇含量的检测,结果表明PjCAS基因发生RNAi的细胞系中植物甾醇含量较普通珠子参细胞明显降低,而总皂苷含量则高于普通珠子参细胞系,说明PjCAS基因的RNAi能够间接参与调控珠子参皂苷的代谢流。采用高效液相色谱法对珠子参中6中重要的单体皂苷——人参皂苷Rd、Rb1、Re、R0和竹节参皂苷IV、IVa进行检测,各单体皂苷含量均有不同程度升高。为了初步明确皂苷增加的机理,检测了珠子参皂苷生物合成途径中的关键酶基因PjDS和PjAS的表达情况,证明PjDS和PjAS的表达量在PjCAS基因RNAi细胞系中均有所提高,说明PjCAS基因表达的下降,减少了甾醇合成支路的代谢流,从而可能间接增加了皂苷合成支路的流量,珠子参皂苷合成的两条支路为了催化处理增加的代谢流,使得PjDS和PjAS基因的表达被动提高,进而增加了珠子参皂苷的合成量。以上研究表明,PjCAS基因对珠子参三萜皂苷合成途径发挥着重要调控作用,PjCAS基因表达的下调可间接增加了皂苷合成代谢流,促进了珠子参皂苷的生物合成。
【学位单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TQ461
【部分图文】：

皂苷,二醇,珠子

第一章研究背景及意义3表1.1珠子参皂苷中的重要三萜皂苷Table1.1TheimportanttriterpenoidsaponinsinP.japonicus图1.1珠子参中20(R)、20(S)-原人参二醇型皂苷类化合物结构母核(A：20(R)-原人参二醇型皂苷；B：20(S)-原人参二醇型皂苷)Fig.1.1Skeletonsof20(R)and20(S)-protopanaxadiol(PPD)typeandtheirglycosidesinP.japonicus单体皂苷取代基母核类型Rb1R1=-Oglc2-1glc,R2=-Oglc6-1glc20(S)-原人参二醇RdR2=-Oglc2-1glc,R2=-Oglc20(S)-原人参二醇ReR1=-OH,R2=-Oglc,R3=-Oglc2-1rha20(S)-原人参三醇ⅠⅤR1=R2=R4=H,R3=ara(f),R5=glc齐墩果烷型BⅠⅤaR1=R2=R3=R4=H,R5=glc齐墩果烷型BR0R1=-glc2-1glc,R2=-glc齐墩果烷型A

珠子,皂苷,人参

昆明理工大学硕士学位论文4图1.2珠子参中20(S)-原人参三醇型皂苷类化合物结构母核（A:20(R)-protopanaxadiol(PPD)saponins;B：20(S)-protopanaxatriol(PPD)saponins）Fig.1.2Skeletonsof20(S)-protopanaxatriol(PPT)andtheirglycosidesinP.japonicus图1.3珠子参中的齐墩果烷型三萜及其皂苷类化合物结构母核（A：齐墩果烷型皂苷母核类型A；B：齐墩果烷型皂苷母核类型B）Fig.1.3Skeletonsofoleanane-typetriterpenesandtheirglycosidesinP.japonicus(A:Skeletonsofoleanane-typetriterpenesA；B：Skeletonsofoleanane-typetriterpenesB)在药用植物中，珠子参以及其他人参属植物如人参、三七、西洋参，都属于世界上销量较高的药材，尤其以人参最受欢迎。“Panax”一词源于希腊语“Panacea”，意为治愈所有人。目前，人参属的物种包括12种，珠子参是其中之

皂苷,珠子,三萜,类型

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