环糊精包合及大分子修饰对其包埋释放行为的影响研究

发布时间：2020-09-19 21:45

　　环糊精(Cyclodextrin,CD)凭借其独特的外亲水内疏水空腔化学结构,与多种小分子形成包合物,显著增加疏水性药物在水中的溶解度,可作为药物载体对敏感性天然药物具有保护和缓释的作用。由于单体环糊精的溶解性、空腔刚性及包合适应性等问题,使环糊精的应用具有一定的局限性。相比于单体环糊精及其衍生物,环糊精聚合物具有良好的水溶性及生物相容性,对客体分子的空间构型及尺寸包容性强,可以包合尺寸大于环糊精腔体的客体分子,在包合能力上具有明显的优势。本文以环糊精为主体,并引入点击化学方法对环糊精进行大分子修饰,研究环糊精单体包合及其大分子修饰聚合物对疏水性药物的包埋与释放行为的影响。首先,探索环糊精空腔疏水性对大分子客体包合效果。选用高疏水性抗菌肽丙甲菌素(Alamethicin,ALM)为模型,采用水溶液法,将γ-CD与ALM制成水溶性γ-CD/ALM包合物。调节γ-CD与ALM的反应摩尔比分别为1:1,5:1和10:1,制备三种相应的γ-CD/ALM包合物:γ-CD/ALM_1,γ-CD/ALM_5和γ-CD/ALM_10。傅立叶变换红外光谱分析证明γ-CD/ALM包合物的形成。包合物的粒径分布结果表明,在高γ-CD/ALM摩尔比下制备的γ-CD/ALM包合物发生一定程度的聚集;γ-CD/ALM包合物对李斯特菌表现出显著的抗菌活性,包合物的最小抑菌浓度(MIC)取决于包合物中γ-CD/ALM的摩尔比,不同γ-CD/ALM包合物的MIC如下:γ-CD/ALM_1为0.429 mg/mL,γ-CD/ALM_5为1.094 mg/mL,γ-CD/ALM_10为2.078 mg/mL;γ-CD/ALM包合物对李斯特菌的最优抑菌活性是环糊精的高溶解性及环糊精空腔对ALM疏水性基团效应共同作用的结果。此外,分子动力学模拟研究表明,在ALM与γ-CD包合过程中,当ALM的疏水性残基进入环糊精空腔中时,形成的γ-CD/ALM包合物结构最稳定;ALM具有多个疏水位点,较大的环糊精空腔及高环糊精浓度更容易与其疏水位点相结合,提高环糊精与客体分子的包合效果。进一步探索环糊精对ALM抑菌机理的影响。通过TEM观察到,γ-CD/ALM包合物可在细胞膜表面形成孔隙,破坏细胞膜结构导致细菌的裂解死亡;荧光染料渗漏试验进一步证实了包合物对细胞膜的裂解作用,同时,在γ-CD/ALM包合物中,γ-CD只是作为载体来促进ALM在水中的溶解度和生物利用度,并不参与诱导膜渗透现象;在0.00015~0.16的肽-脂质体比范围内,染料渗漏程度随抗菌肽-脂质体摩尔比的增加而增大,γ-CD/ALM_5引起的染料渗漏程度最高,这与之前证明的γ-CD/ALM_5具有最高的抑菌活性相一致;分子动力学研究表明γ-CD/ALM包合物可以有效地结合在磷脂双分子层表面;γ-CD/ALM(1/1)包合物跨膜分子动力学研究表明,γ-CD/ALM包合物中的ALM以-螺旋形构象聚集,在磷脂双层膜之间形成类似桶状孔隙结构的水通道;圆二色光谱表明,γ-CD/ALM包合体中的ALM在溶液中呈-螺旋形构象,在脂质体存在的情况下亦如此。这些结果证明环糊精通过包合作用改变ALM在水溶液中的存在构象,ALM从无规则结构变为-螺旋形构,使其在水溶液中具有抑菌活性。通过环糊精单体对抗菌肽的包合研究发现,高环糊精浓度更容易与大分子客体进行包合作用,因此引入硫醇-烯点击化学反应的绿色合成方法,将环糊精单体聚合修饰为高分子环糊精聚合物,提高环糊精的局部浓度,从而提高环糊精对客体分子的包合作用。首先分别对β-CD硫醇化改性为β-CD-(SH)_7,羟丙基β-CD马来酰亚胺改性成HPCD-AMI,然后将两者的水溶液混合,通过马来酰胺亚胺与硫醇基之间的环加成反应,得到水溶性高分子环糊精聚合物,并对聚合物进行结构表征。核磁图谱及红外图谱分析表明,合成的聚合物中保留了环糊精结构,同时还含有部分未反应的马来酰亚胺基团;X射线衍射表明环糊精聚合物呈现不规则的无定形结构;排阻色谱法测得透射电子显微镜观察结果表明,环糊精聚合物在水溶液中呈壳-核球状结构;粒径分析测得环糊精的粒径为20nm。通过调节HPCD-AMI与β-CD-(SH)7的投料比和反应温度,得到一系列不同的环糊精聚合物。分子量测定结果表明:随着HPCD-AMI比例的增加,环糊精聚合物的相对分子量增大;投料比固定,随着反应温度的升高,得到的环糊精聚合物相对分子量增大;核磁研究表明,随着反应温度的提高,环糊精聚合物中马来酰亚胺的消耗增加,聚合物结构的交联度提高;相溶解度试验表明,环糊精聚合物显著提高了姜黄素在水中的溶解度,在相同的底物浓度下,姜黄素在β-CDPs水溶液中的溶解度比在β-CD中提高了10到60倍。其中CDP-50(30)对姜黄素的增溶效果最为显著,为β-CD的60倍;聚合物对姜黄素的包埋能力取决于聚合物相对分子量和聚合物的微观结构。最后,引入另一种点击化学法-Diels-Alder点击反应,将环糊精修饰到壳聚糖上形成大分子水凝胶。首先,对壳聚糖进行糠醛基功能化改性,调节壳聚糖与糠醛的投料比分别得到三种不同糠醛取代度的改性壳聚糖(CF1,CF2和CF3)。然后,将CF与HPCD-AMI水溶液,在不同温度下,通过发生糠醛基团与马来酰亚胺之间的Diels-Alder反应,形成了化学交联的水凝胶。对得到的水凝胶成胶时间、溶胀度、流变学行为、药物吸附及释放动力学等进行研究,结果表明:改性壳聚糖中糠醛取代度越高,凝胶化时间越短;由SEM观察发现,水凝胶为表面光滑的片状结构;水凝胶的溶胀度对pH具有敏感性,当pH值低于6.0时,水凝胶的溶胀度随pH值的升高而减小,当pH值高于6.0时,水凝胶溶胀度随pH值的升高而增大。水凝胶的流变学行为分析发现,当改性壳聚中糠醛取代度从2.6%提高至28.3%,形成相应水凝胶的储能模量的范围从1 pa升至1200 pa,这表明水凝胶的强度可以通过反应物的化学计量比调节;药物吸附分析表明,在CFCD凝胶中引入环糊精可提高药物的吸附能力,且水凝胶对甲基橙的吸附符合二级动力学方程;水凝胶对甲基橙的释放速率为初始阶段很快,然后逐渐变缓。此外,24 h后PBS缓冲液中甲基橙累积释放量仅为48.85%,表明CFCD水凝胶在装载药物有很好的持续释放能力。
【学位单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TQ460.1
【部分图文】：

分子结构图,γ-环糊精,α-环糊精,β-环糊精

β-和 γ-CD），分别由 6，7，8 个葡糖糖单元构成。图 1-1 给出环环糊精分子呈截顶圆锥状腔体结构，它们的圆柱形结构深 0.79 nm环糊精结构中各个 D-吡喃葡萄糖单元皆处于椅式构象，其中 C-6 ，构成环糊精的小端口；C-2 和 C-3 位上的羟基为仲羟基，组成环 C-5 位上的氢原子及糖苷键上的氧原子组成环糊精的内腔;具有 H CH 基团主要位于分子的外侧面，羟基朝向圆锥的外表面。这种精分子具有内腔呈疏水性，而外侧及端口呈一定亲水性的特性。精低极性的空腔结构能够部分或全部包埋各种大小、形状、结构和，从而形成一种非共价键的结合[2]。另外，环糊精分子中存在的大量CD 和 γ-CD 分子中分别含有 18、21 和 24 个羟基，可以使其它分子通过取代反应或化学修饰到不同的位置（大端口或小端口）。这些羟端口的 C6 位羟基，其亲和性最高，活性也最强；还有是位于环糊精羟基，前者亲核性最差，后者因空间位阻较大难以接近。因此可低对环糊精端口的羟基进行选择性取代，继而可形成多种取代位置物，用于特定的应用领域[3]。

偶极环加成,叠氮

、DNA 等等本质上也是高分子，同时又处于细胞环境以及水存在的条质的可控化学反应就更加的困难，而点击化学的出现就为解决这种生学反应提供了重要的出路。目前，点击化学在高分子化学、生物标记域获得了广泛的应用。击化学的反应类型和叠氮的 1，3-偶极环加成反应应是目前应用最多和发展最完善的点击化学反应，如图 1-2 所示，炔的催化下可以区域选择性地生成三唑环[40]。它的反应条件温和，产物期分离纯化。在高分子化学领域广泛应用于聚合物的偶联、后修饰。广泛地用于生物分子的表面改性或与聚合物的偶联。由于生物分子的使用的环状炔烃，无需再加入铜盐。这类点击化学反应可以在水中发应速率高，对温度不敏感。另外，炔与叠氮基大多数常见的官能团都此对反应体系具有很好的兼容性。但这类点击化学反应的最大缺点就主要是因为在有机物中，叠氮基团基本都是通过叠氮化钠（NaN3）的到的，可是叠氮化钠剧毒，且易爆。

示意图,环加成反应

图 1-3 Diels-Alder 环加成反应Fig. 1-3 Diels-Alder cycloadditon醇-烯化学反应[42-43]-4 为硫醇-烯点击反应示意图。虽然为点击化学大家庭的重要成员，但就是不太稳定的，经常有被氧化的、偶联成二硫键的。巯基本身的亲对很多体系都是不兼容的。图 1-4 硫醇-烯烃反应Fig. 1-4 Thiol-ene reaction性酯与氨基的取代反应反应如图 1-5 所示。该类点击反应也是近些年来才被人们慢慢重视并在蛋白质的改性中尤其重要，因为蛋白质的氨基酸侧链中有很多赖

【参考文献】