金属钙离子与碱性蛋白酶的相互作用及应用研究

发布时间：2020-09-24 10:32

【摘要】：碱性蛋白酶是一种在碱性pH范围内,通过催化水解连接氨基酸的肽键来催化蛋白质分解代谢的特殊蛋白质。目前碱性蛋白酶广泛用于生活的方方面面,包括洗涤剂制造,皮革加工,烘焙合成行业,因此成为最主要研究的蛋白酶类型。碱性蛋白酶的性能受到多种因素(pH、离子强度、温度和机械操作)的影响。具有优良性能的碱性蛋白酶可以进一步优化工艺流程,因此总是处于需求状态。对于工业应用,碱性蛋白酶在比较不利的环境下也必须具有活性,因此蛋白酶需具有工艺适应性和长期稳定性。由于传统工艺生产的酶活性较低,再加上蛋白酶在环境条件极端改变时,其结构变得无序,酶活性降低甚至丧失,使得碱性蛋白酶的应用受到了限制。考虑到这一点,碱性蛋白酶活性的激活剂成为蛋白酶制剂实际应用中需要考虑的重要因素。研究表明Ca~(2+)是大多数蛋白酶的激活剂和稳定剂,来提高酶的活性,结合在蛋白酶特定位点以保护酶的构象。因此,本论文选取已知结构的碱性蛋白酶PB92作为研究对象,其结构中有两个Ca~(2+)结合位点,选择氯化钙和甲酸钙来研究金属钙离子对碱性蛋白酶的作用。本文主要研究了氯化钙和甲酸钙对碱性蛋白酶PB92活性的影响,通过动态光散射实验和相互作用的荧光光谱探讨了二者相互作用的机理。第一,通过测定加入不同浓度的氯化钙和甲酸钙后,碱性蛋白酶PB92酶活力的变化,得到1 mmol/L到5 mmol/L浓度范围内的氯化钙和甲酸钙在温度40℃、pH 10.5下对蛋白酶的酶活均有促进作用,其中氯化钙相对甲酸钙对碱性蛋白酶PB92酶活的促进作用更加明显。第二,测定了加入不同浓度Ca~(2+)后,碱性蛋白酶PB92粒径和蛋白酶溶液电位的变化。加入不同浓度Ca~(2+)后粒径变化表明,Ca~(2+)的加入使得碱性蛋白酶PB92的平均粒径减小,疏水结构逐渐向蛋白酶内部转移,从而蛋白酶的结构更为紧密,有利于蛋白酶酶活力的提高。加入不同浓度Ca~(2+)后蛋白酶溶液电位变化表明,随着浓度逐渐增大Ca~(2+)所带的正电荷使带负电荷的碱性蛋白酶逐渐趋向于电中性,其结果是双电层变薄,Zeta电位负值逐渐减小,消除了带电基团对酶的不利影响,有利于酶活力的保持。第三,研究了Ca~(2+)与碱性蛋白酶PB92结合后荧光强度的变化,发现Ca~(2+)对碱性蛋白酶PB92具有一定的猝灭作用。根据Stern-Volmer公式对其猝灭机理的探讨,得到了Ca~(2+)与碱性蛋白酶PB92的结合位点数n=1.90,结合常数K_b=6.03×10~5 L/mol,确定了Ca~(2+)对碱性蛋白酶的猝灭机制为单一的静态猝灭,且Ca~(2+)与碱性蛋白酶的结合能力很强。通过Ca~(2+)与碱性蛋白酶计算得到的热力学参数分析可知Ca~(2+)与碱性蛋白酶通过静电作用力形成稳定的复合物,且结合过程能够自发进行。最后,研究了Ca~(2+)提高碱性蛋白酶催化活性在洗涤剂中的应用。研究表明其他洗涤条件相同时,添加蛋白酶的洗涤剂和添加加钙蛋白酶的洗涤剂对国标蛋白污布JB02和自制血渍污布的去污效果明显高于未添加蛋白酶PB92及Ca~(2+)的洗涤剂。洗涤效果(好—差)排序均为:添加加钙蛋白酶PB92的洗涤剂添加蛋白酶PB92的洗涤剂市售洗涤剂。通过光学显微镜观察发现,蛋白污布纤维表面和缝隙中的蛋白污渍被去除。尤其是在添加蛋白酶PB92的洗涤剂、添加加钙蛋白酶PB92的洗涤剂中洗涤后,污布单根纤维表面变得光滑明亮,并且纤维排列也较整齐分明。由洗涤前后ATR-FTIR图变化可知,Ca~(2+)与碱性蛋白酶PB92协同作用于国标污布JB02和血渍污布的污渍,针对性的催化水解连接氨基酸的肽键来催化国标污布JB02污渍和血渍中的蛋白质分解代谢,相较使用不添加Ca~(2+)和碱性蛋白酶PB92的洗涤剂进行洗涤,去污效果得到改善,洗涤效果有一个显著性的提高。
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ649.1
【图文】：

序列,碱性蛋白酶,一级结构

引言动植物和微生物都可以生产碱性蛋白酶，微生物（主要是芽孢杆菌等）生白酶的优越性表现在微生物可以在适宜条件下大量培养[1]。碱性蛋白酶是pH范围内，通过催化水解连接氨基酸的肽键来催化蛋白质分解代谢的特殊目前碱性蛋白酶广泛用于生活的方方面面，包括洗涤剂制造，皮革加工行业，因此成为最主要研究的蛋白酶类型。碱性蛋白酶碱性蛋白酶的结构层次碱性蛋白酶可以催化水解连接氨基酸的肽键来催化蛋白质分解代谢。蛋白尤其是空间构象的稳定性对于蛋白酶的催化作用来说是不可或缺的[3-5]。碱性蛋白酶的一级结构如图 1.1 所示，基因 DNA 序列的改变可能导致碱基酸序列的改变，而即使只改变碱性蛋白酶序列中的一个氨基酸，也会影白酶的整体结构和功能。

碱性蛋白酶,二级结构,三级结构

图 1.2 碱性蛋白酶的二级结构Fig.1.2 Secondary alkaline protease structure多肽的整体三维结构为碱性蛋白酶的三级结构，主要是由于构成蛋白酶的的相互作用[7]，如图 1.3 所示。有助于三级结构的 R 基团相互作用包括氢键、偶极间相互作用、伦敦力（色散力）以及整个范围内存在的共价键。如电荷的 R 基团相互排斥，而具有相反电荷的 R 基团可以形成离子键[8]。另互作用对三级结构也至关重要，具有非极性疏水性 R 基团的氨基酸在蛋白聚集在一起，在外部留下亲水性氨基酸以与周围的水分子相互作用[9]。最特殊类型的共价键可以促成三级结构：二硫键。二硫键是半胱氨酸的含硫的共价键，比其他类型的有助于三级结构的键强得多[10]。它们像分子“安一样起作用，使多肽的部分牢固地相互连接。

碱性蛋白酶,三级结构,亚基