蛋白质工程改造的Baeyer-Villiger单加氧酶催化多功能性反应研究
发布时间：2020-09-26 17:16
Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMO)作为一种重要的生物催化剂,具有选择性高、反应条件温和、高效等优点,可以催化各种有机酮/醛化合物的Baeyer-Villiger氧化反应,以及一些含硫、硒、硼等杂原子底物的非天然氧化反应。BVMO催化的选择性氧化反应已被广泛应用于各种手性化合物的合成中。近年来,利用生物信息学分析和基因挖掘技术,从众多微生物中找到了多种新型的BVMO;而利用蛋白质工程技术对已知的野生型BVMO进行改造,可以改善酶的立体、区域和化学选择性,扩大底物范围,提高酶的热稳定性和反应活性。随着国内外相关研究的进展,Baeyer-Villiger单加氧酶在有机合成中的应用将进一步得到拓宽。本论文通过对CHMO以及PAMO的蛋白质工程改造,以期提高其催化活性和选择性;并分别用这些突变株催化α-酮酯的还原反应以及硼有机化合物的氧化拆分反应,研究突变结构对2种非天然反应的催化活性和立体选择性的影响。具体研究内容和结果如下:首先,本论文根据CHMO催化Baeyer-Villiger氧化反应的机理,提出了利用CHMO催化循环中黄素的还原态将α-酮酯还原为α-羟基酯的假设,探讨了CHMO催化α-酮酯还原的多功能性反应。在选择苯甲酰甲酸乙酯作为模型底物底物并控制多个反应条件和多个对照实验的情况下,最终验证了CHMO的确具备相应的还原能力。进一步选择了CHMO活性中心附近的8个氨基酸残基进行定向进化,通过筛选后获得了具有优异活性和R构型立体选择性的突变株L143F,其ee值为98%,还获得了立体选择性反转的突变株F277L。继而利用CHMOL143F突变株考察了全细胞状态下,反应温度、诱导剂浓度、pH环境、沉淀菌株等条件对反应的影响。最后,设计了8种拓展底物研究了该还原反应的普适性和底物范围。其次,本论文研究了PAMO催化α-苯乙基频哪醇硼烷的非天然氧化拆分反应。但在全细胞环境中,野生型PAMO的立体选择性很差。定向进化研究发现,PAMO的活性位点Loop上67以及440-446位点与底物的特异性以及空间选择性有密切联系。我们选用野生型PAMO为模板,在上述6个位置进行定向进化,构建单突变文库。通过筛选,最终发现I67Q突变株可将产物立体选择性由野生型的25%(S)提高到72%(S),而S441E突变株实现了产物的优势构型由S逆转为及,产物的ee值为45%。考虑到硫醚类底物与模型底物的相似性,我们选择以突变株4M(167Q/P440F/A442N/L443I)为模板,将 67、440、442、443位点突变为不同大小以及不同酸碱性的氨基酸,进一步探索能实现更高尺构型立体选择性的突变株。最终发现构成4M的4种单突变的产物优势构型都是S构型,而4M突变的优势产物为及构型,进一步验证了杂原子氧化反应机理的相似性,但以4M为模板的其他突变并未获得高立体选择性的筛选结果。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TQ426.97
【部分图文】：
模型中无法分析辅因子的机制［１９１。为进一步提升同原模型的可用性和准确性，逡逑２０１４邋年邋Ｐａｔｒｉｃｉａ邋等人基于来源于邋／？／？ｏｔ／ｏｃｏｃｃ７？邋ｓｐ．．ｓ７ｒａ／？／／／－＿？／邋的邋ＣＨＭ0Ｒｈ邋的晶体逡逑结构（ＰＤＢｃｏｄｅ：４ＲＧ３）图１－２，成功构建出包含ＮＡＤＰＨ的ＣＨＭＯａ■丨。的新型逡逑同源模型，并使用多组实验数据验证其可靠性［２（）｜。虽然ＣＨＭＯＡｃｉｎｅｔ。的晶体结逡逑构到目前还未解明，但由于ＣＨＭＯＲｈ与ＣＨＭＯＡｃｍｅｔ。在活性位点附近有非常高逡逑的同源性，２０１９年Ｗｕｑｉ等人也根据ＣＨＭＯａｈ的晶体结构（ＰＤＢｃｏｄｅ：４ＲＧ３），逡逑构建了邋ＣＨＭＯＡｃ，＿的同源模型［２１］。逡逑％逡逑图１－２邋ＣＨＭＯＲｈ三维立体结构（ＰＤＢ１Ｄ：４ＲＧ３）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＣＨＭＯＲｈ邋（ＰＤＢ邋ＩＤ：邋４ＲＧ３）逡逑
图２－４ｐＢＡＤ＿ＰＡＭＯ质粒图谱逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－４邋Ｐｈｙｓｉｃａｌ邋ｍａｐ邋ｏｆ邋ｐＢＡＤ邋ＰＡＭＯ邋ｐｌａｓｍｉｄ逡逑２．２．１．４实验仪器逡逑
ＣＨＭＯ催化ａ－酮酯的非天然还原反应逡逑图３－１所示，野生型的ＣＨＭＯ的分子量大概是７０邋ｋＤａ，对应Ｐｒｏｔｅｉｎ邋Ｍａｒｋｅｒ的逡逑相应条带位置，ＣＨＭＯ的条带清晰，无太多杂质。逡逑\l．逡逑q咤澹罚板澹耄模徨濉义洗炕祝藻澹茫龋停襄义稀鲥义希停幔颍耄澹蝈义贤迹常币吧停茫龋停系模樱模樱校粒牵拍旱缬就煎义希疲椋纾酰颍邋澹常卞澹校酰颍椋妫椋澹溴澹穑颍铮簦澹椋铄澹铮驽澹鳎椋欤溴澹簦穑邋澹茫龋停襄澹幔睿幔欤澹溴澹猓澹樱模樱校粒牵佩义希常玻跺澹茫龋停洗呋幔サ幕乖从﹀义先赴低常哄义戏直鹧∮靡吧停茫龋停稀⑽拗柿４蟪Ω司拢蹋玻保模牛场⒋校穑牛裕玻玻猓ǎ┛赵劐义现柿＃ㄎ蓿茫龋
本文编号：2827255
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TQ426.97
【部分图文】：
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本文编号：2827255
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