链霉菌ZX01发酵工艺及其糖蛋白GP-1抗植物病毒制剂的研发

发布时间：2020-09-28 12:33

　　植物病毒病是造成农业生产损失的最严重病害之一,有“植物癌症”之称。微生物作为天然活性产物的重要生物资源库,从中开发出高效、低毒、广谱、安全的抗植物病毒剂一直是植物病毒病防治领域的热点。链霉菌ZX01(Streptomyces kanasensis ZX01)是西北农林科技大学无公害农药研究服务中心从新疆喀纳斯湖附近的土壤中筛选到的一株具有抗烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)活性的新型链霉菌,采用活性跟踪法从该菌株的发酵产物中分离到了活性成分——糖蛋白GP-1。本文在课题组前期研究的基础上,以链霉菌ZX01为供试菌株,从培养基优化、发酵条件控制、发酵规模扩大等方面进行研究,以期最大程度地提高糖蛋白GP-1的产量,并以糖蛋白GP-1为有效成分研制出一种新型的抗植物病毒制剂。本文的主要结果如下:(1)对链霉菌ZX01产糖蛋白GP-1的摇瓶发酵工艺进行了初步研究,确定了其种子培养基、发酵培养基以及摇瓶发酵条件。种子培养基成分为:可溶性淀粉20 g/L、NaCl0.5 g/L、FeSO_4·7H_2O 0.01 g/L、K_2HPO_4 0.5 g/L、KNO_3 1 g/L、MgSO_4·7H_2O 0.5 g/L,种龄72 h;发酵培养基为成分为:可溶性淀粉13.6 g/L、酵母粉4.2 g/L、NaCl 3.5 g/L、CaCO_3 0.3 g/L、小米10 g/L;发酵条件为:接种量6%、初始pH6.5、摇床转速150 rpm。在最佳摇瓶发酵工艺下发酵7 d,糖蛋白GP-1的产量达到了0.93 mg/L,相比于优化之前(0.35 mg/L)提高了168%。(2)对链霉菌ZX01产糖蛋白GP-1的发酵罐操作工艺进行了优化,在5 L发酵罐上研究了温度、搅拌速度和通气量对糖蛋白GP-1产量的影响,确定了最佳操作工艺为:温度30℃、搅拌速度200 rpm、通气量2.0 vvm。采用以上控制条件进行4批验证试验,得到的平均糖蛋白GP-1的产量为3.92 mg/L,相当于摇瓶发酵水平的4.2倍。(3)采用恒定的体积氧传递系数(k_La)作为放大准则,成功实现了链霉菌ZX01产糖蛋白GP-1的中试发酵放大,发酵规模从5 L逐级放大到15 L和70 L,糖蛋白GP-1的产量相对稳定,分别达到了3.92 mg/L、4.03 mg/L、3.82 mg/L。(4)在5 L发酵罐中研究了链霉菌ZX01的发酵动力学,分别采用Logistic方程和Luedeking-Piret方程建立了其细胞生长与产物形成动力学模型,能较好地反映链霉菌ZX01发酵合成糖蛋白GP-1的过程。细胞生长动力学模型:(?)糖蛋白GP-1合成动力学模型:(?).(5)研制出一种以糖蛋白GP-1为有效成分的新型抗植物病毒剂——0.5%糖蛋白GP-1水剂,其配方为:0.5%糖蛋白GP-1(有效成分)、5%烷基糖苷APG(表面活性剂)、1%卡松(防腐剂)、1%乙二醇(防冻剂)、1%聚二甲基硅氧烷(消泡剂)、自来水补足至100%(溶剂)。(6)室内盆栽与田间小区试验均表明0.5%糖蛋白GP-1水剂在防治烟草花叶病毒病方面表现出很好的持效性。制剂的200倍稀释液对TMV的室内防效在药后的5 d、10d及15 d分别达到了76.28%、75.73%、67.85%,对TMV的田间防效在药后的第10 d、20 d及30 d分别为42.39%、47.40%和43.09%。综上所述,本文围绕链霉菌ZX01生产糖蛋白GP-1的发酵过程进行系统的研究,不但提高糖蛋白GP-1的产量,还扩大了其发酵生产规模,为实现其工业化生产提供一定理论基础和技术支持。另外,在此基础上研制出的抗植物病毒剂,为完善植物病毒病的综合防治提供依据。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TQ920.6;TQ458
【部分图文】：

路线图,路线,链霉菌,糖蛋白

善植物病毒病的综合防治提供参考。本文的主要研究工作将用单次单因子和响应面分析相结合的统计试验方法，对链霉菌行优化，主要研究培养基和摇瓶条件对糖蛋白 GP-1 产量的影响摇瓶优化试验的结果为基础，在 5L 发酵罐中对链霉菌 ZX01 优化，主要研究温度、搅拌速度、通气量等对糖蛋白 GP-1 产量 5 L 发酵罐研究的基础上，将链霉菌 ZX01 产糖蛋白 GP-1 的发酵规模逐级扩大到 70 L。 5L 发酵罐中研究链霉菌 ZX01 的发酵动力学，建立其细胞生型。糖蛋白 GP-1 为有效成分进行抗植物病毒制剂的研制，并对制测以验证产品质量的合格性，通过室内盆栽试验以及田间药效草花叶病毒病的防治效果。技术路线如下：

生长曲线,细胞干重,链霉菌,培养基

图 2-1 10 种培养基对链霉菌 ZX01 细胞干重的影响Fig.2-1 Effects of 10 media on DCW of Streptomyces kanasensis ZX01 h 的摇瓶培养，ZX01 菌株在种子培养基中均形成了直径 1~5摇床旋转时产生的离心作用，很多菌丝都附着到了瓶壁上进行看出高氏一号培养基、ISP4 培养基和 ISP3 培养基均能提供殖的环境，它们中的细胞干重分别为 6.18 ± 0.09、6.02 ± 0.19 培养基具有个共同点：成分中无氮源，却含有多种无机盐提供01 菌株的生长繁殖对于氮源的需求并不高，反而是无机离子长。最后，综合考虑试验结果和配方成本，确定高氏一号培养殖的最适种子培养基。生长曲线和种龄的确定一号为种子培养基对链霉菌 ZX01 进行 120 h 的培养，并对培测定，结果如图 2-2 所示。ZX01 菌株的生长分为 4 个时期：0长速度较低，只有 0.0308 g/(L·h)；12~84 h 为对数期，细胞生h)；84~96 h 为稳定期，细胞生长速度慢慢降低，并在 96 h 时达

糖蛋白G,培养基,糖蛋白

图 2-3 10 种培养基对糖蛋白 GP-1 产量的影响Fig.2-3 Effect of 10 media on glycoprotein GP-1 production养基对糖蛋白 GP-1 产量的影响如图 2-3 所示。结果表明，GP-最高，达到了 0.3454mg/L，与其他培养基有显著的差异；其次105 mg/L）和黄豆粉培养基（0.3003 mg/L），它们中的 GP-1 ；ISP1~ISP6 培养基的 GP-1 产量分别为 0.2575 mg/L、0.26432 mg/L、0.2103 mg/L 以及 0.2850 mg/L；相比之下，以高氏一产量只有 0.1907mg/L。一般来说，如果培养基中营养物质过长，从而抑制代谢产物的合成，如果营养物质过少，则细胞易32

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