米曲霉脂肪酶AOL的酶学性质、晶体学及定点突变研究

发布时间：2020-10-09 20:13

　　甘油单酯和二酯脂肪酶是一类具有特殊底物选择性的脂肪酶,它们几乎只作用于甘油单酯和甘油二酯底物,而不作用于甘油三酯底物。其特殊的底物选择特性使其在工业应用中极具潜力。酶蛋白三维结构的解析,有利于深刻理解该类酶的结构功能关系,并为酶的理性改造提供结构基础。遗憾的是,目前单酯与二酯脂肪酶晶体结构信息仍然缺乏。本课题以来源于米曲霉的甘油单酯和二酯脂肪酶Aspergillus oryzae lipase(AOL)为研究对象,采用毕赤酵母异源表达了该脂肪酶并表征了其酶学性质,解析了其晶体结构,利用定点突变和生物信息学分析等方法初步研究了AOL结构和功能关系。主要研究内容以及结果如下:(1)AOL在毕赤酵母中异源表达、纯化及酶学性质研究。发酵了AOL组成型表达的毕赤酵母工程菌株,利用阴离子交换层析对重组AOL进行分离纯化,SDS-PAGE分析发现目标蛋白条带不均一。去糖基化酶处理实验证实,AOL在毕赤酵母中异源表达发生了糖基化。酶学性质表征结果显示:重组AOL的最适温度为50℃,最适pH为6.0。在中温(30~50℃)、偏酸性及中性条件下比较稳定,最适醇和脂肪酸底物分别为甘油和癸酸。(2)AOL的基因克隆以及在大肠杆菌中异源表达、纯化。为获得无糖基化修饰的AOL蛋白,将AOL基因克隆至pFL-B13cl表达载体上,并转化至大肠杆菌SHuffle T7中进行异源表达。在15℃、0.4mM IPTG条件下诱导培养18小时后,大部分SUMOAOL重组蛋白为可溶表达。利用SUMO蛋白酶酶切结合镍柱纯化可获得纯度较高的无SUMO蛋白标签的重组AOL蛋白。(3)AOL的晶体结构解析。采用凝胶过滤层析进一步纯化获得高纯度的AOL蛋白。在蛋白浓度10mg/m L、20℃、0.1M Bis-Tris pH6.4、41%w/v polypropylene glycol P400条件下获得了具有较高衍射质量的晶体。AOL的晶体结构(PDB ID:5XK2)通过分子置换的方法得以解析,其分辨率为1.7?。AOL呈现典型的α/β水解酶折叠结构,由8个β折叠片和11个α螺旋组成。AOL的催化三联体由Ser153、Asp206和His268组成,氧负离子洞由Ser91和Leu154的主链NH基组成。(4)AOL突变体的制备及酶学性质研究。根据AOL晶体结构的分析和参考已有的研究成果,选择V269关键位点进行定点突变。构建获得了V269I、V269L、V269E、V269Q、V269D、V269R和V269A 7个突变体,并通过毕赤酵母表达和离子交换层析纯化,获得了较高纯度的重组AOL突变体蛋白。甘油二酯底物水解结果显示,相比于野生型,亲水性氨基酸替代突变体V269D、V269E、V269R、V269Q水解活力分别有6.1、3.0、2.5、1.2倍的增加。甘油和油酸底物酯化实验结果发现,亲水性氨基酸替代突变体V269D、V269E、V269R、V269Q的酯化活力分别有2.6、1.6、1.6、1.4倍的增加。小体积氨基酸替代突变体V269A的水解活力和酯化活力分别有2.3和1.2倍的提高。然而,强疏水性氨基酸替代突变体V269L和V269I的水解活力和酯化活力有轻微的下降。最后,采用了同源模拟和分子对接等生物信息学手段初步探讨了V269位点各个突变体活力变化的原因。
【学位单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TQ925.6
【部分图文】：

氨基酸序列,水解酶,折叠片,脂肪酶

来除去皮革胶原纤维间及皮毛上的油脂，从而提高产品的弹性和柔软度[2业中，脂肪酶不仅可以增加洗涤产品的去污能力，还可以降低洗涤产品对]；在造纸工业中，脂肪酶可用来除去纸浆中的甘油三酯和蜡酯等疏水性油张的加工过程[22]。肪酶的结构特点然脂肪酶在氨基酸序列和分子大小上可能存在较大的差异，但是它们在空度保守，几乎呈现相似的 α/β 水解酶折叠。如图 1-1 所示，典型的 α/β 水个 β 折叠片和连接这些 β 折叠片的 α 螺旋构成。除了 β2 与其它折叠片反向折叠片都平行分布[23,24]。α/β 水解酶折叠的活性中心由高度保守的催化三氨酸-酸性的天冬氨酸或者谷氨酸-组氨酸）构成。亲核的丝氨酸通常位于间的 loop 急转弯处，该结构被称为亲核肘，这种绷紧扭曲的结构有利于好的暴露，从而更易进攻酯质底物碳基正离子发生水解反应[25]。

催化机理,脂肪酶

肪酶的催化机制催化三联体和“盖子”结构外，脂肪酶还有一个重要的结构原件——“氧负肪酶行使催化功能起了重要的作用[28]。脂肪酶的催化机制遵循经典的丝机制，属于“乒乒乓乓”类型[29]。具体反应过程如图 1-2 所示，当酯质底酶活性位点结合后，催化三联体中的 His 的咪唑基团会夺取亲核 Ser 侧使该羟基上的氧原子带部分负电。随后亲核 Ser 上带负电的羟基氧会亲酯键中被抢夺了电子的羰基碳正离子，并与底物羰基碳原子结合形成共原件的“氧负离子洞”的两个氨基酸残基主链的酰胺基团与底物中带部氧原子形成氢键，从而稳定脂肪酶-底物四面体过渡态。随后，酯键断裂放离去，亲核丝氨酸与底物中的酰基部分共价结合形成酰基化酶复合体is 会夺取水分子的一个质子，形成的 OH-亲核进攻酰基化酶复合体的羰基释放一个质子给丝氨酸，丝氨酸与底物酰基部分共价键断裂释放，酶释次恢复为游离的状态。

技术路线图,课题研究,酶学性质,异源表达

华南理工大学硕士学位论文研究内容围绕来源于米曲霉的甘油单酯和二酯脂肪酶 AOL 开展以下研究：AOL 在毕赤酵母中异源表达以及重组 AOL 的纯化和酶学性质研究；AOL 在大肠杆菌中异源表达以及重组 AOL 纯化；AOL 结晶条件的筛选、晶体数据收集、解析和晶体结构描述；基于 AOL 晶体结构的分析选取可能影响催化功能的关键位点 V269 进行设计突变体；对纯化的突变体进行酶学性质研究，分析实验数据，采用同源建模和分分析模拟，从蛋白分子结构上探究突变体对酶学性质的影响。技术路线

【参考文献】