苏云金芽胞杆菌新型杀虫基因的发掘与活性分析

发布时间：2020-10-11 11:52

　　 苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)因对多种农业害虫具有特异的杀虫活性,且对非靶标生物安全、环境友好等优点,使其成为世界上应用最为广泛的微生物杀虫剂。其杀虫活性主要源自于菌株本身所产生的杀虫蛋白,这些杀虫蛋白主要由cry基因和vip基因编码,其中cry基因已被应用于转基因作物20余年。因此,发掘Bt杀虫基因对害虫的防治具有重要意义。目前杀虫基因发掘的主要手段是高通量测序技术,但是由于测序价格较高,且菌株资源库中的重复菌株较多,会造成较大的资金浪费,迫切需要建立大量菌株的比较分析方法,以去除重复菌株,获得用于杀虫基因发掘的菌株。当大量菌株测序完成后,后续通常花费较多时间对菌株的基因组测序数据组装和杀虫基因注释,因此提高杀虫基因发掘效率是十分必要的。现阶段对Bt杀虫基因的发掘仍然具有很大需求,由于某些害虫对现有的Bt杀虫蛋白不够敏感,缺少对某些新靶标害虫具有活性的Bt杀虫蛋白,以及害虫对转基因作物表达的Cry蛋白的抗性问题,因此发掘杀虫活性高且与转基因作物中的Cry蛋白无交互抗性的新型Bt杀虫蛋白非常重要。针对上述需求,本论文围绕Bt菌株分离技术、杀虫基因发掘方法和具有杀虫活性的Bt新基因的筛选鉴定展开研究,主要结果如下:1、Bt菌株的分离技术研究:本研究以基于PCR-RFLP技术的Bt杀虫基因指纹图谱为依据对分离的大量菌株比较分析。首先对菌株基因组提取方法改良,改用磁珠法DNA提取技术可以实现快速高通量提取菌株基因组DNA。然后对引物系统改良,增加引物用于检测更多的杀虫基因。PCR-RFLP图谱分析系统改良,利用基于毛细管电泳系统原理的核酸片段分析仪可以分析比较大量菌株的PCR-RFLP图谱,并且大量菌株的图谱信息可以以数字化的形式输出。进一步结合生物信息学方法计算菌株PCR-RFLP图谱的相似性,最终可以实现对分离的大量菌株中的重复菌株进行去除,获得可用于进一步杀虫基因发掘的菌株。2、Bt菌株混合基因组测序数据中杀虫基因发掘研究:本研究首先模拟了1个Bt菌株混合基因组原始测序数据,然后测试了不同基因组组装软件的组装效果,包括单菌基因组组装软件(IDBA、Velvet)和宏基因组组装软件(IDBA-UD、MetaVelvet),结果显示IDBA-UD软件组装结果最佳,获得的N50及平均序列长度最长。宏基因组基因预测软件MetaGeneMark预测结果显示IDBA-UD组装结果对应预测到的编码基因N50最长。杀虫基因预测结果显示IDBA-UD对应的编码基因库中发掘到的杀虫基因数量最多,达到14个Bt菌株杀虫基因总数的78%。3、具有杀虫活性的Bt新基因筛选:本研究利用二代测序技术分析了78个Bt菌株的基因组,从中获得了大量与已有杀虫基因具有相似性的新基因。对部分(96个)新基因进行杀虫活性筛选,其中包括第一等级的新基因31个,第二等级的新基因48个,第三等级的新基因16个,第四等级的新基因1个。将这些新基因在大肠杆菌中克隆和表达,结果显示有92个新基因可在大肠杆菌Rosseta(DE3)中表达。最后对表达的蛋白进行杀虫活性分析,结果筛选获得了1个对鳞翅目害虫小菜蛾和亚洲玉米螟具有杀虫活性的新型杀虫基因cry9C-like,而其余91个新基因对几种常见鳞翅目害虫和鞘翅目大猿叶甲未表现出杀虫活性。4、新型Bt杀虫蛋白Cry9Cb1的鉴定:对上面研究中筛选出的cry9C-like新型杀虫基因展开研究,首先将基因序列提交至NCBI GenBank中,获得登录号MK005301,并被Bt毒素命名委员会命名为cry9Cb1。该基因在Bt无晶体突变株HD73~-中可以表达约130 kDa的蛋白,原子力显微镜观察发现该蛋白为球形晶体蛋白。生物活性测定结果表明Cry9Cb1对多种鳞翅目害虫具有很高的杀虫活性,其中对小菜蛾LC_(50)值为0.38μg/mL,对亚洲玉米螟LC_(50)值为1.28μg/mL,对水稻二化螟LC_(50)值为0.50μg/mL。对小地老虎和东方黏虫表现出中度的杀虫活性,LC_(50)值分别为130.22μg/mL和244.77μg/mL。亚洲玉米螟对Cry9Cb1与Cry1Fa不产生交互抗性。Cry9Cb1对小菜蛾的最小活性区位于72~T~657~V,对亚洲玉米螟的最小活性区位于68~D~655~A。食用安全性评价结果表明:Cry9Cb1与已知过敏蛋白无序列同源性,并且在热处理及模拟胃肠液中快速降解和失活。总而言之,本论文从Bt杀虫基因发掘上展开研究,发掘方法的改良对提高Bt杀虫基因发掘效率具有重要作用;筛选和鉴定高毒力的新型杀虫基因将为Bt杀虫剂的改良和Bt转基因作物的研制奠定良好的基础。
【学位单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q78;TQ453
【部分图文】：

芽胞杆菌芽胞杆菌简介杆菌（Bacillus thuringiensis，简称 Bt）在专业分类书籍《伯归属于第二类第十八群，兼性厌氧菌，革兰氏染色呈阳性，的一种[1]。菌体生长前期，菌体形态呈杆状。当菌体生长至央可形成一个卵圆形的芽胞，到衰亡期时，芽胞囊破裂，芽，菌体的一端或两端产生伴胞晶体，此晶体随芽胞的释放而描电子显微镜下呈现不同形状，主要为双锥体形、球形、方称为杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Proteins，ICPs），对鳞翅ptera）、双翅目（Diptera）、膜翅目（Hymenoptera）、同翅目（ra）、食毛目（Mallophaga）、线虫（Nematode）及螨类（Mite于这类蛋白具有杀虫活性强、对非靶标生物安全且对生态环化学杀虫剂用于防治农林害虫有价值的工具[5-7]。

图 1-4 目前使用的 Bt 毒素命名体系Figure 1-4 The current used Bt toxin nomenclature system体毒素白是在细菌生长至稳定期时产生的伴胞晶体状物质[5, 19]，最为人熟知ry 毒素和 Cyt 毒素。根据同源性和结构，Cry 蛋白被分成了很多类。活性的晶体毒素有 Cry 和 Ps 两种命名，这些蛋白或者属于三个结Ps1，Cry41 或 Ps3，Cry63 或 Ps6），或者属于对人类癌细胞具有特异X2 家族蛋白（Cry45 或 Ps4，Cry46 或 Ps2，Cry64 或 Ps5）[44]。白构成了一个较小的独特晶体蛋白群，这些蛋白对双翅目幼虫具有很蚊子和黑蝇[45-49]；除此之外，某些 Cyt 蛋白与其他的 Bt 蛋白具有协同素白被命名为 Cry 蛋白源于它可以形成一个伴胞晶体（Crystal）。Cry 蛋源家族蛋白，而是包括很多不相关的类型。最大的一类就是具有三个家族，而其他的 Cry 蛋白则属于不同的蛋白家族，例如由球形芽胞杆TX_MTX2 类[51, 52]

1-9 害虫对 Bt 作物产生抗性的全球状况。每个符号表示 1 个国家的 1 种害虫对 Bt 转玉米、棉花或大豆中的 1 种毒素的反应[110]。gure 1-9 Global status of pest resistance to Bt crops. Each symbol indicated the responses ofpest species in one country to one toxin in Bt corn, cotton, or soybean[110].
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本文编号：2836555