辅因子NADPH调控谷氨酸棒杆菌合成L-赖氨酸时胞内微环境的生理机制

发布时间：2020-10-12 04:51

　　 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)在维持谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)细胞生长和L-赖氨酸合成中起重要作用。该文通过敲除参与C.glutamicum胞内NADPH合成途径中的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf和苹果酸酶基因malE,并将自身NADP~+-依赖型异柠檬酸脱氢酶基因icd_(Cg)替换为变形链球菌(Streptococcus mutans)NAD~+-依赖型异柠檬酸脱氢酶基因icd_(Sm),构建一株阻断胞内NADPH合成的工程菌株C.glutamicum LYS?zwf?malE?icd_(Cg)::icd_(Sm)。并比较分析阻断胞内NADPH合成对菌体生长、葡萄糖代谢和L-赖氨酸合成的影响。通过添加不同浓度的NADPH溶液以确定维持细胞L-赖氨酸合成能力最适NADPH阈值范围,并分析胞内微环境参数的变化规律,从而初步解析胞内辅因子NADPH水平调控胞内微环境的生理机制。主要研究结果如下:(1)重组菌胞内NADPH含量降低至0.15μmol·(g DCW)~(-1),明显低于出发菌1.43μmol·(g DCW)~(-1),同时胞内NADH含量由出发菌1.97μmol·(g DCW)~(-1)提高至2.73μmol·(g DCW)~(-1),实现了异柠檬酸脱氢酶辅酶依赖型的转变。ATP含量降低13.10%,而ADP和AMP含量均有所升高。摇瓶发酵结果表明,重组菌葡萄糖代谢能力明显减弱,生长也相对缓慢,菌体生物量降低4.36%。同时L-赖氨酸产量降低87.69%,而在胞内积累了大量副产物,如丙酮酸、乳酸等。(2)培养基中添加不同终浓度NADPH溶液考察其对L-赖氨酸生产强度的影响。与未添加NADPH相比,当NADPH终浓度为0.2 mmol·L~(-1)、0.5 mmol·L~(-1)、1 mmol·L~(-1)、2mmol·L~(-1)和4 mmol·L~(-1)时菌体生物量分别提高7.98%、11.77%、22.28%、15.86%和6.52%,L-赖氨酸产量分别提高1.16倍、4.87倍、9.59倍、11.54倍和7.61倍,而L-赖氨酸生产强度分别提高0.08倍、3.36倍、6.84倍、8.96倍和6.14倍。实验结果表明在培养基中添加一定量辅因子NADPH时,菌体生长、L-赖氨酸产量及其生产强度均得到了一定恢复,当过量添加时其促进作用均明显减弱。伴随着NADPH含量的提高,L-赖氨酸生产强度呈现出先逐渐增强后逐渐减弱的趋势。(3)对不同NADPH阈值浓度0 mmol·L~(-1)、0.5 mmol·L~(-1)、2 mmol·L~(-1)和4 mmol·L~(-1)下胞内能量辅因子(AMP,ADP,ATP)、氧化还原辅因子(NAD~+,NADH,NADP~+,NADPH)、乙酰-CoA和活性氧簇(ROS)进行定量分析和差异比较,并初步解析了胞内辅因子NADPH水平调控胞内微环境的生理机制。当NADPH阈值浓度为0 mmol·L~(-1)、0.5mmol·L~(-1)、2、4 mmol·L~(-1)时胞内NADPH水平分别为0.15μmol(g DCW)~(-1)、0.24μmol(g DCW)~(-1)、1.83μmol(g DCW)~(-1)和2.65μmol(g DCW)~(-1),ATP水平分别为4.21μmol(g DCW)~(-1)、4.32μmol(g DCW)~(-1)、4.48μmol(g DCW)~(-1)、4.67μmol(g DCW)~(-1),胞内ROS水平分别提高1.35%、1.79%和15.21%。实验结果表明,当NADPH阈值浓度低于2 mmol·L~(-1)时,阈值浓度的提高可以有效提高胞内NADPH、ATP水平和L-赖氨酸生产强度,降低胞内NADH水平,增强乙酰-COA供给并强化中心碳代谢途径。然而当NADPH阈值浓度超过2 mmol·L~(-1)时,阈值浓度的提高使得L-赖氨酸生产强度逐渐降低,同时胞内NADH水平提高并伴随着乙酰-CoA减少,中心碳代谢弱化。此外,在高NADPH阈值浓度下活性氧簇(ROS)增强,而过高的ROS水平引起细胞氧化应激反应,最终导致细胞凋亡,菌体生物量减少。
【学位单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TQ922.3;Q78
【部分图文】：

第一章 绪论第一章 绪 论理化性质腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide adenine dinu原型辅酶Ⅱ，是动、植物以及微生物细胞内极其重质量为 744.41，分子式为 C21H29N7O17P3，其结构观呈现白色粉末状，在自然条件下极易潮解。易体可在 0℃或密封干燥的室温环境中稳定存在[2]。

NADPH 可以减少细胞内氧化型化合物，从而维持细胞中的最佳对微生物产物积累具有显著影响，如在 Corynebacterium glutmicum 中成途径均需NADPH提供还原力，其中L-赖氨酸合成所需的NADPH因子 NADPH 工程来强化代谢产物的积累[13-17]。子 NADPH 的代谢途径、植物以及微生物细胞中普遍存在 NADPH 合成代谢途径，如在戊糖)以及 TCA 循环中存在某些酶可以将 NADP+催化还原成 NADPH，当酶途径可以实现胞内 NADH(NAD+)和 NADPH(NADP+)相互转化。NA化而形成 NADPH，同时也可通过 NAD 激酶先将 NAD+磷酸化形成胞内多种 NADP+依赖型脱氢酶催化作用，将 NADP+还原成 NADPH如大肠杆菌(E. coli)中还存在两种不同类型的吡啶核苷酸转氢酶，该酶 与 NADH 之间的互相转变。DPH 的常规合成途径

图 1-3 异柠檬酸氧化脱羧反应Fig. 1-3 The oxidative decarboxylation of isocitrate目前在自然界高等动、植物和大多数微生物细胞中发现存在两种辅酶依赖型不同柠檬酸脱氢酶，一种是以 NAD+为辅酶，需要以镁离子或锰离子激活，这种酶只存线粒体中，另一种则是在胞内线粒体以及细胞基质中发现的以 NADP+为辅酶的异酸脱氢酶。该酶参与催化氧化脱羧反应，解决了动物，植物和微生物细胞乙酰基氧降解的问题，这在生物学中具有重要意义。同时该酶还是一种活性会被 ADP 变构的变构调节酶，可通过调节细胞内 ADP 水平改变其与底物之间的亲和性以调控代率。研究发现，在 Saccharomyces cerevisiae S288C、家鼠以及人类等细胞胞浆中该以 NADP+为辅因子,并将其还原为 NADPH[22, 23]。.2.2 NAD 激酶途径NAD 激酶包含 NAD+激酶和 NADH 激酶这两种类型，该酶通过以 ATP 或多聚无酸(PolyP)作为磷酸供体，可以分别将NAD+和NADH磷酸化并生成NADP+和NADPAD 激酶催化的反应是从头合成 NADP+和 NADPH 的最后一步，同时也是目前已知
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本文编号：2837670