基于丝网印刷电极(Screen printed carbon electrode,SPCE)的电化学免疫传感器因造价低、可批量生产、免除复杂前处理、一致性好以及易于修饰等优点大程度上挑战了传统固体电极在电化学免疫传感器领域的研究与应用。但在实际应用中,SPCE面临着诸如“绝对灵敏度好,相对灵敏度差,导致检测结果平行性差,从而影响实验重现性”、“电极面积较小,导致抗体负载量较低,从而影响实验灵敏度”、“鲜有人关注电极的重复利用和再生”等问题。聚苯胺(PANI)是共轭聚合物典型代表之一,因其成本低廉、合成方便、热稳定性好、可快速掺杂和去掺杂等特点,近年来在电化学免疫传感器领域很受重视。本研究以PANI为基础,结合多种纳米复合材料,选择E.coli0157:H7为检测模型,从电极表面修饰物的稳定性和牢固性入手,制备出一种表面极其稳定和导电性非常好的“活化电极”:SPCE-PANI-AuNPs,以改进电化学免疫传感器的检测性能,特别是实现活化电极的再生和重复利用,达到高效、经济和环保的目的,并通过制备三种不同的免疫传感器,以期通过研究提高、对比和选择最佳,促进SPCE和电化学免疫传感器在食品安全领域的发展与应用。具体研究内容如下:1.基于稳定的还原态聚苯胺薄膜定量检测E.coli O157:H7为解决SPCE修饰物牢固度低和稳定性差的问题,本章采用恒电位法(potentiostatic method)在SPCE上电沉积PANI:苯胺单体在工作电极上分三个阶段发生氧化聚合,生成PANI颗粒或PANI膜,通过控制沉积时间和沉积电压来控制PANI所处的反应阶段,从而控制PANI的分子结构和形貌;再结合纳米金(gold nanoparticles,AuNPs)的生物相容性,进一步活化SPCE;最后从相对简单的“直接法”入手,构建一种新型的E.coli O157:H7电化学免疫传感器,实现对目标菌的定量检测。在最优实验条件下,电流强度与E.coli O157:H7菌液浓度的对数值呈线性关系,线性范围为4.0×104至4.0×109CFU/mL,最低检测限(LOD)为7.98 ×103 CFU/mL。在对奶粉样品进行的加标回收实验中,回收率在81.00%至95.50%之间。恒电位法电沉积得到的PANI薄膜不仅能够提升电极表面的电子传递速率,还能提高电极比表面积,提供更多的活性位点以供AuNPs的连接。相较于通过循环伏安法(Cyclic Voltammetry,CV)沉积得到的PANI膜,恒电位法制备的PANI膜极其稳定,可以经受住强酸(HC1)、强碱(NaOH)以及超声处理。AuNPs作为PANI和Ab的连接剂,不仅可以进一步提高电极表面的导电能力,还能避免PANI(-NH3)和Ab(-COOH)直接相连时所需化学试剂(如EDC/NHS)导致Ab失活或自我交联的问题。最重要的是,超稳定的PANI为后续“活化电极的再生”打下基础。2.基于稳定聚苯胺薄膜和金铂复合金属纳米粒子/中性红功能化还原氧化石墨烯的可再生E.coli O157:H7电化学免疫传感器研究为进一步提高电化学免疫传感器的灵敏度以及实现活化电极的再生,本章合成了金铂复合金属纳米粒子(Au@Pt nanoparticles,Au@Pt);制备了中性红(neutral red,NR)功能化的还原氧化石墨烯(rGO-NR),并通过静电吸附作用将带负电荷的Au@Pt吸附在rGO-NR上;再基于Au-N键结合原理将抗体(Ab2)吸附到Au@Pt上,制备得到捕获探针rGO-NR-Au@Pt-Ab2-BSA;将该探针与活化电极SPCE-PANI-AuNPs共同孵育E.coli O157:H7形成夹心结构,实现对目标菌的定量检测;最后,通过10 min一定强度的超声将夹心结构除去,实现活化电极的再生。在最优实验条件下,还原峰电流变化值(Reduction peak current change,AI)与E coli O157:H7 菌液浓度的对数值呈线性关系,线性范围为8.9 ×103至8.9 ×109 CFU/mL,LOD为2.84 ×103 CFU/mL。在对市售猪肉和牛奶样品进行的加标回收实验中,回收率分别在80.90%至91.01%和88.76%至106.74%之间。5次再生的平均变异系数为8.47%,说明传感器至少可以重复使用5次。在该纳米复合探针中,NR大大提升了 rGO的分散性,使其具有极高的比表面积;Au@Pt则因Au-N键使得探针具有极好的生物相容性,又因催化双氧水(hydrogen peroxide,H2O2)的性能解决了酶传感器在使用过程中易失活的问题。相较于第一章,除了检测限得到一定提升以外,最重要的是基于PANI的稳定性实现了活化电极的再生,为下一章活化电极再生的进一步深入研究打下基础。3.高催化活性金铂复合金属纳米粒子修饰的纳米金掺杂聚苯胺微球对可再生E.coli O157:H7电化学免疫传感器的改进研究为缩短免疫传感器的构造时间,研制一种更安全快捷、绿色环保的新型探针,缩短活化电极再生的时间,提高活化电极再生的次数,本研究用氯金酸(Chloroauric acid,HAuCl4)溶液做氧化剂,氧化前驱体苯胺,在盐酸环境下制备了纳米金掺杂的聚苯胺微球(AuNPs@PANI microspheres,AuNPs@PANI);再合成金铂复合金属纳米粒子(Au@Pt nanoparticles),通过Au-N键吸附于AuNPs@PANI表面,孵育抗体(Ab2)后与活化电极形成夹心结构。在对活化电极的再生处理中,缩短一半的超声时间,并评估增加一倍的再生次数后活化电极的检测性能。在最优实验条件下,还原峰电流变化值(Reduction peak current change,ΔI)与E.coli O157:H7菌液浓度的对数值呈线性关系,线性范围为8.9×104 至 8.9×109CFU/mL,LOD 为 3.0×103CFU/mL。在对市售牛奶样品进行的加标回收实验中,回收率在75.28%至105.62%之间。5 min的超声时间可以实现对活化电极的再生,10次再生处理后,活化电极的检测性能与初始无显著性差异(p0.05)。相较于第二章,本章所构建的传感器主要有两个优点:(1)探针制备更经济高效、绿色安全。在制备rGO-NR-Au@Pt过程中.Hummer法合成氧化石墨烯工序耗时较长,且存在一定安全隐患。而制备AuNPs@PANI-Au@Pt可缩短约90%的耗时,且反应条件温和、简单;(2)深入探究了电极的再生,将活化电极再生时间从10 min缩短至5 min,重复利用次数从5次增加至10次。综上,本研究所构建的三种E.coli O157:H7电化学免疫传感器层层递进,从电极表面修饰物的稳定性切入,最终实现了电化学免疫传感器的再生。其意义在于:(1)从工作效率出发,制备活化电极耗时近24 h,而再生活化电极耗时仅需5 min,这将大大提高工作效率,节省工作时间;(2)从环保角度出发,SPCE作为一种不易降解的塑料制品,大量一次性消耗必将带来“白色污染”。实现SPCE的再生是符合绿色环保可持续发展原则的;(3)从经济角度出发,SPCE的单价虽然不高,但是积少成多也是十分可观。从一次性使用变为10次重复使用,直接将经济成本降至百分之十。虽然所构建传感器的LOD值均为103CFU/mL,看似并非十分敏感,但因源自3 μL的菌样检测,第二章相当于在直径2 mm的SPCE表面检测出了约20个菌,其中第三、四章均不到10个,这已经是一个十分灵敏的结果。
【学位单位】：浙江工商大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TP212;TQ317;TB33
【部分图文】：
Ｆｉｇ．?１－３?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｓｕｂｓｔｒａｔｅ?ｃａｔａｌｙｓｉｓ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ??ｓｔｒａｔｅｇｙ?ｉｎ?ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ??１．３．３．３底物循环放大策略??底物循环放大策略通常与酶催化放大技术联用，是指电信号物质在测试体系??中通过氧化还原作用循环反应来提高检测的灵敏度的方法［２２］。Ｔａｎｇ等［４２］用金纳??米颗粒功能化的多壁碳纳米管来标记抗体形成夹心免疫模型。测试液中加入的对??硝基苯酚可在ＮａＢＨ４的作用下还原，在纳米粒子的催化下，其产物与电极表面??的电化学活性物质（Ｔｈｉｏｎｉｎｅ）产生了底物循环，放大电流，提高了检测的灵敏度。??传感器构建步骤及检测原理如图１－４所示。??
??／??图１－３免疫传感器中底物催化放大策略??Ｆｉｇ．?１－３?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｓｕｂｓｔｒａｔｅ?ｃａｔａｌｙｓｉｓ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ??ｓｔｒａｔｅｇｙ?ｉｎ?ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ??１．３．３．３底物循环放大策略??底物循环放大策略通常与酶催化放大技术联用，是指电信号物质在测试体系??中通过氧化还原作用循环反应来提高检测的灵敏度的方法［２２］。Ｔａｎｇ等［４２］用金纳??米颗粒功能化的多壁碳纳米管来标记抗体形成夹心免疫模型。测试液中加入的对??硝基苯酚可在ＮａＢＨ４的作用下还原，在纳米粒子的催化下，其产物与电极表面??的电化学活性物质（Ｔｈｉｏｎｉｎｅ）产生了底物循环，放大电流，提高了检测的灵敏度。??传感器构建步骤及检测原理如图１－４所示。??輪參??ａｎｔｉ－．＼￥Ｐ??［ｈｉ〇ｘ?ｉｉ．ｉｕｘ??ＣＮＴ?ＡｕＮＰ－ｉｉ／ｉ／ｉ?ＡＦＰ?ＡｕＮＰ＾ｉ／ｉ／ｉ－ＡＦＰ??图１－４免疫传感器中底物循环放大策略应用??９??
??中的电压和时间是影响ＰＡＮＩ状态和导电性的关键因素。从图２－２?Ａ中可以看出，??沉积电压在０．４４?Ｖ至０．５４?Ｖ之间时，随着电压的增大，ＰＡＮＩ的导电性也随之??增大。当沉积电压达到０．５２?Ｖ之后，所得到的ＰＡＮＩ在表征时从原来的一对氧化??还原峰（０．２?Ｖ处，见图２－２?Ｃ）变成了两对峰（０．２?Ｖ处和０．５?Ｖ处，见图２－２?Ｄ）。出??现在０．５?Ｖ处的峰介于还原态氧化为中间态的峰（０．２?Ｖ）和中间态进一步氧化为氧??化态的峰（０．８?Ｖ）之间［６９］。这意味着在ＰＡＮＩ的沉积过程中，聚合物主链上发生了??相受损，有研宄者认为这个介于两者之间的氧化还原峰是苯醌／对苯二酚对。因??为在相对较高的电位下ＰＡＮＩ中亚胺基会过度氧化，亦或是ＰＡＮＩ中的吩嗪环发??生交联［６４］。不同的沉积电压可以得到不同状态的ＰＡＮＩ，高电压可以加速苯胺在??电解液中的聚合
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2841373
