酿酒酵母中虾青素生物合成及其代谢调控的研究

发布时间：2020-10-18 10:42

　　 虾青素是自然界中一种具有较强抗氧化能力的类胡萝卜素,其中的3S-3'S构型生物学活性最高,在医药品、食品、饲料以及化妆品等生产领域具有广泛的应用价值。为了提高虾青素的生产效率,降低生产成本,本文以酿酒酵母为操作平台,以蛋白质分子改造和动态代谢调控为手段,开展一系列合成生物学方面的应用基础研究,构建产虾青素的酿酒酵母细胞工厂,实现虾青素的高效生物合成。首先,从雨生红球藻中克隆了 β-胡萝卜素酮化酶和β-胡萝卜素羟化酶基因,并通过密码子优化提高了其表达量。将这两个基因整合到产β-胡萝卜素酿酒酵母工程菌中,成功合成了 3S-3'S构型的虾青素。在明确这两个酶的底物选择性后,进一步对这两个酶进行了拷贝数的精细调控,最终通过整合各两个或三个拷贝的OBKT和OCrtZ,获得YPP9和YPP13菌株,虾青素含量分别达到3.54 mg/g DCW和 4.20 mg/g DCW。为了进一步提高虾青素产量,代谢前体物的充足供应和高效转化是必要条件。为此,首先用红发夫酵母牻牛儿基牛儿基焦磷酸(GGPP)合酶的阳性突变体CrtE03M替换出发菌株YPP0中的野生型CrtE,构建的Ycarot-02菌株中前体物质β-胡萝卜素的产量提高56%,达到了 16.37mg/gDCW。其次,通过类胡萝卜素之间的颜色差异,建立了 OBKT的定向进化策略,获得了一株OBKTM阳性突变体,促进了 β-胡萝卜素向下游产物的转化,与表达野生型OBKT的对照菌株相比,β-胡萝卜素的转化率提高了 50%,同时角黄素的产量提高了 1.4倍。结合OBKTM、CrtE03M和途径中其它关键酶基因的过表达,以及辅因子Fe2+的添加,使构建的双倍体菌株YastD-03的虾青素含量达到8.10 mg/g DCW(47.18 mg/L)。在此过程中发现,OCrtZ的酶活也是制约虾青素产量的一个关键因素,因此进一步对OCrtZ和OBKTM进行了共定向进化,获得了 OCrtZM1和OBKTM29突变体,在Ycarot-02菌株中同时表达这两个阳性突变体后,构建的YPP-27菌株虾青素含量达到了 5.70 mg/gDCW,相比于OCrtZ和ObktM组合表达时提高了 38.7%。虽然YPP-27产量低于之前构建的双倍体YastD-03,但由于代谢压力相对较小,菌株的遗传稳定性更好。在对构建的产虾青素酿酒酵母菌株进行发酵研究的过程中,发现类胡萝卜素过早积累会对细胞生长造成不利影响,最终影响高密度发酵。为了解决人工合成途径和底盘细胞之间的相互干扰,在接下来的研究中基于GAL调控系统,开发了一套温度响应的动态调控系统,使细胞生长和产物积累分成两个阶段进行。在敲除GAL80基因的基础上,GAL启动子的活性只受转录激活因子Ga14的控制。基于以上原理,首先利用番茄红素作为指示来建立高通量筛选方法,筛选出了一株温度敏感并且在目标温度保留较高调控活性的突变体Gal4M9,通过温度优化发现在24℃时,Ga14M9的活性最佳。然后,利用报告基因EGFP的表达情况以及番茄红素合成途径中基因的转录水平,对基于Ga14M9构建的温敏型调控系统进行了表征,确认了其温度响应特性。随后,利用番茄红素作为试验产品,构建了温度调控的Ylyc-TS03(+)菌株,在高密度发酵实验中,成功实现了细胞生长和产物合成阶段的分离,并且番茄红素产量达到了 1.14g/L。最后,将该温敏调控系统进一步应用到了虾青素的生物合成中,构建了温敏型菌株Yast-TS9,在摇瓶发酵中表现出明显的温度响应,温度从30℃切换至24℃后虾青素产量提高了 28倍,含量为4mg/gDCW。在补料发酵中,OD600达到了 250左右,实现了高密度发酵,类胡萝卜素的积累也呈现了严谨的温度调控模式,最后总类胡萝卜产量达到 505 mg/L。本研究结合基因挖掘、表达优化、蛋白质工程、动态代谢调控等手段,成功构建了产虾青素酿酒酵母工程菌株。这项工作有效地将理论研究和应用研究进行结合,将为虾青素的生物合成提供技术支持,同时研究过程中开发的蛋白质改造和代谢调控策略将为利用酿酒酵母合成其他高附加值化合物提供方法借鉴。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TQ929
【部分图文】：

１．１．３．１虾青素的生理功能??与Ｐ－胡萝卜素、番茄红素等分子不同，虾青素除了含有疏水性的主碳链外，??两端还含有亲水性的羟基和酮基，使其可以横跨细胞膜（如图１．２）?［６］，通过血??脑屏障，因此与位于磷脂双分子层内部的Ｐ－胡萝卜素、番茄红素等相比能更好抵??抗脂质过氧化。由于虾青素具有很强的抗氧化能力，不仅可以有效地清除细胞内??外的氧自由基，减少衰老细胞的堆积，也可以预防心血管疾病、癌症类疾病以及??一些免疫系统上的疾病［７］，在保护机体、维持机体平衡方面具有重要的意义。??ＶＩＴＡＭＩＮ?Ｃ??Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ?Ｆｌｕｉｄ?（Ｓｙｃｏｐｒｏｉｅｒ?ｐ＇＂?Ｍｔｔｒｔｘａｎｅ??（ＣｅＨ?ｅｘｔｅｒｉｏｒ）?／?Ｊ？．?严伽??ｔ?＾?＾?／??■＊〇（＞＜？?／?Ｇｔｙｃ〇Ｗ）？Ｊ??３Ｓ．３Ｓ＇ＡＳＴＡＸＡＮＴＨＩＮ?｜｝．ｐ－ＣＡＲＯＴＥＮＥ?Ｊ??“?Ｍｅｍｂｒａｎｅ?．???—Ｎｕｃｌｅｕｓ??＆?ＣｅＮ?：??图１．２类胡萝卜色的细胞膜储存模型［６］??Ｆｉｇｕｒｅ?１．２?Ｓｔｏｒａｇｅ?ｏｆ?ｃａｒｏｔｅｎｉｏｄｓ?ｉｎ?ｃｅｌｌ?ｍｅｍｂｒａｎｅ??２

衍生合成的。首先乙酰辅酶－Ａ?（Ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ）经过曱羟戊酸途径（ＭＶＡ途径）??或者丙酮酸盐和３－磷酸甘油醛经过２－曱基－Ｄ－赤藓糖醇－４－磷酸途径（ＭＥＰ途径）??合成ＩＰＰ和ＤＭＡＰＰ［１１，３Ｇ］（如图１．３所示），其中ＭＶＡ途径主要存在于酵母等真??核细胞中，而ＭＥＰ途径存在于大部分的细菌和植物的质体中［３１，３２］。??ＭＶＡ?ｐａｔｂ、ｖａ＾￣ｌ?ＭＥＰ?ｐａｔｈｗａｙ??Ａｃ？ｔ＞ｌ－ＣｏＡ?Ｐｊｔｕｖ＊ｔｉｒＫ；！ｙｃｅｒ８ｌｄｃｈｙｄｅ＞３－ｐｈｏｓｐｈａｔｃ??Ｉ?——?ＤＸ—?ｊ?ｄｘｓ??Ａｃｃｔｏａｃｅｆｊｌ－ＣｏＡ?ＣＡＡＣｏＡ）?ｌ－Ｄｅｏｘｙ－Ｄ－ｘｊ?ｌｕＩｏｓｃ－Ｓ－ｐｈｏｓｐｈａｔｃ?（．?ＤＸＰ）??｜ＨＭＧ－ＣｏＡｓｖ＊ｎｔ｝？ａｓｃ?ＤＸＰ?ｒｃｄｕｃｕ．＾?Ｉ?＾??３－ｈｙｄｒ〇Ｘｙ－３－ｎｉｃｔｈ．ｖＩ－ｇｌｕｔａｒ＞！－ＣｏＡ?（ＨＭＧ－Ｃ?ｏＡ）?２－Ｃ：－ｍｃｔｈ＞１－Ｄ－ｃｍｌｉｒｉｒ〇！－４－ｐｂ〇ＳｐｈａＵ（ＭＥＰ）??｜?ｒｅｄｕｃｔａｓｅ?｛ｔＨＭＧ?ｌ）?ＣＤＰ－ＭＨ?Ｔｒａｎｓｔｅｒａｓｅ?｜??Ｍｅ％ａｌｏｎｕｔｃ?＾ｒＤｒ－ＭＮｎｕｔｈｙｌ－Ｄ－ｉｒｊＩｈｒｆｔｏｌ?（ＣＤＩ＾ＭＫ）??｜?Ｍｃ＼！ａｌｏｉｗ！ｃ?ｋｉｎａｓｅ?ＣＤＰ－ＫｆＥ?ｋｉｎａｓｅ?Ｉ?ｉｓｊｔＥ??Ｍｃ＾？ｉｏｎ？ｔｃ－５－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ??Ｉｐｈｏ．ｐｈｏｒａｅｖａｋｍａｔｃｋ

的３和３’碳位各加一个羟基和４和４’碳位各加一个酮基，在大部分产虾青素的??生物体中，该过程需要两个酶Ｐ－胡萝卜素羟化酶（ＣｒｔＺ）和（３－胡萝卜素酮化酶??（ＣｒｔＷ或者ＢＢＣＴ）催化（如图１＿４所示）。??ＩＰＰ?ＤＭＡＰＰ??］ＥＲＧ２０??人八＾￣—￣＊ＳＱｕａＩｅｎｅ－???Ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ??Ｃｒｔｆｃ：?（Ｘ．ｄ．）｜?ＲＴＳＩ?（Ｓ．ｃ．）??纖＊：?以??｜?ＣｒｔＹＢ??Ｐｈｙｔｏｅｎｅ??Ｉ?ｃｍ??Ｌｙｃｏｐｅｕｅ??Ｖ?Ｅｄｊｉｎｅｎｏｎｅ?〇；ｊ＾＾ｐ－ｃｒｙｐ（ｏｘａｎｔｈｉｎ??＂＂Ｖ＇＇?３－ｈｙｄｒｏｘ》ｅｃｈｉｎｅｎｏｎｅ??ｕ?ＣａｎｔｈａｘｆｌｉｉＵｉｉｎ?Ｚｅａｘａｎｔｈｉｎ??ＣｒｌＺ＼?Ｙ＾Ｓ＇－ｈｖｄｒｏｘｖｅｃｈｉｎｅｎｏｎｅ?／（ｎ＇ｖ??＼?ｗ??一丫?Ａｓｉａ＾ｎ＾??图１．４虾責素的生物合成途径??Ｆｉｇｕｒｅ?１．４?Ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ?ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ?ｐａｔｈｗａｙ??７??
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本文编号：2846196