黑蛋巢菌与秦岭链霉菌中活性成分挖掘及生物合成初探

发布时间：2020-10-18 11:36

　　 微生物天然产物因其结构多样,生物活性显著,以及次级代谢产物重现性好,成为了药物或药物先导分子的重要源泉。本文充分利用实验室研究平台,旨在挖掘微生物中的活性化合物,主要是以一株胡可黑蛋巢菌和一株秦岭苔藓土壤链霉菌为研究对象,优化其发酵条件,利用正反相色谱层析、葡聚糖凝胶层析、高速逆流色谱技术和高效液相色谱等多项技术对菌株发酵提取物进行分离纯化,并对黑蛋巢菌中分离得到的一对互变异构体进行了衍生化,综合运用1D/2D NMR、MS、IR和UV等波谱分析方法鉴定出了48个化合物,其中包含10个新天然产物和14个新衍生物;化合物绝对构型的鉴定主要结合CD、ECD、X-ray单晶衍射及化学反应等方法。同时,对其中43个化合物进行了多种生物活性评价及作用机制探讨。最后,对特殊生境来源的链霉菌H2S5做了全基因组测序,从生物信息学角度分析了其代谢潜能,并初步探索了其遗传操作体系。主要研究结果如下:1、基于表观遗传修饰策略,从真菌Cyathus hookeri CGMCC 5.1116中分离鉴定了23个化合物,包括6个新鸟巢烷型二萜,命名为cyahookerin A-F(3-1~3-6),其中化合物3-1和3-2为首例报道的含二氧戊环基团的鸟巢烷型二萜,并利用X-ray单晶衍射、化学反应以及CD计算方法确定了新化合物的绝对构型。NGF诱导的PC-12细胞促神经突起生长活性结果显示,化合物3-3在10μM时的分化率高达32.02%,约为NGF对照的2倍。H_2O_2诱导的PC-12细胞氧化损伤的抑制活性结果显示,化合物3-15活性最高,IC_(50)值为7.81μM。LPS诱导的BV-2小胶质细胞炎症抑制活性显示,化合物3-9具有明显的抗神经炎活性,IC_(50)值为6.9μM。SAR分析可知,C-12位引入醛基或缩醛基团、C-13位引入羟基以及C-12和C-13之间的α,β-不饱和醛基团均有利于抗炎活性的提高。通过与iNOS的分子对接模拟初步探讨了这类化合物的抗炎活性机制。以上几种活性评价结果表明,该类鸟巢烷型二萜可作为开发治疗神经退行性疾病的先导药物,尤其是化合物3-3。2、基于多样性导向合成策略,将一对互变异构的鸟巢烷型二萜3-16衍生化,纯化鉴定了14个新的衍生物。神经营养活性和抗神经炎活性结果均显示,化合物3-16的活性高于供试的12个衍生物,且3-16在10μM时NGF诱导的PC-12细胞分化率高达23.65%,约为NGF对照的1.5倍,与作用浓度呈现正相关的量效关系。神经保护活性结果表明,衍生物4-3a、4-3b、4-4a、4-4b、4-6a、4-6b的IC_(50)值在13.96-33.56μM之间,均优于母体化合物3-16。3、综合HPLC分析以及活性向导,从80株秦岭放线菌中筛选出了一株可可链霉菌H2S5作为目标菌株,从其培养物中共分离鉴定出了11个三烯霉素,含4个新化合物,命名为trienomycin J-M(5-1~5-3,5-11)。其中5-11为第二例含葡萄糖基团的三烯霉素类化合物,并通过化学反应方法确定了新化合物的绝对构型。对前列腺癌细胞PC-3和肝癌细胞HepG2的细胞毒活性结果显示,除化合物5-11外,其余10个三烯霉素均有明显的细胞毒活性,化合物5-4和5-7对两株细胞的细胞毒活性均高于阳性对照阿霉素,且IC_(50)值均小于0.7μM。化合物5-1对HepG2的细胞毒活性最高,IC_(50)值为0.1μM;Hoechst染色、细胞凋亡和细胞周期检测结果表明5-1是通过将细胞滞留在细胞周期的S期来促进细胞凋亡。除化合物5-11外,化合物5-1~5-10均表现出非常显著的抗神经炎活性,其中有8个化合物的活性明显高于阳性对照槲皮素。化合物5-1,5-4和5-7的IC_(50)值分别为0.09μM,0.02μM和0.03μM。SAR分析可知,C-13位的羟基以及C-11位丙氨酸残基所连的羧酸链均有助于抗神经炎症活性提高。与iNOS的分子对接模拟结果,从理论上揭示出这类化合物是通过其骨架上的苯酚基团与iNOS活性位点中的Trp463上的芳香环相连进而发挥抗神经炎活性。4、对秦岭链霉菌H2S5进行了全基因组测序,分析结果显示,其基因组为10.04Mb,GC含量为71.0%,含31个次级代谢产物基因簇,涉及I型、II型、III型PKS、NRPS和PKS-NRPS等多种类型,展示出了巨大的代谢潜能。经与已报道的mycotrienin基因簇(myc)的基因功能比对分析,确定tym基因簇为三烯霉素类化合物的生物合成基因簇。5、利用LC-MS对链霉菌H2S5代谢粗提物中的多个组分进行了定性标定;通过绘制trienomycin A的标准曲线,计算出了野生型H2S5菌株中trienomycin A的理论产量为5.7 mg/L。测试了菌株H2S5的抗生素敏感性,确定了生孢培养基,从多方面尝试了大肠杆菌与H2S5之间的接合转移条件;同时针对tym基因簇中的调控基因、骨架合成基因PKS以及负责前体合成的基因构建了5个遗传改造用载体。总而言之,本研究通过研究一株真菌和一株特殊生境链霉菌的化学成分及其生物活性,挖掘出了极具开发前景的治疗神经退行性疾病以及前列腺癌与肝癌的药物先导分子,并为这株链霉菌的生物合成研究奠定了坚实的研究基础。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TQ460.1
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
主要符号对照表
附件
第一章 文献综述
    1.1 微生物天然产物研究策略
        1.1.1 单菌株多次级代谢产物策略
        1.1.2 特殊生境来源微生物资源的挖掘
        1.1.3 基因组挖掘
        1.1.4 合成生物学
    1.2 鸟巢烷型二萜研究进展
        1.2.1 鸟巢烷型二萜结构多样性
        1.2.2 鸟巢烷型二萜的生物活性及构效关系
    1.3 安莎霉素研究进展
        1.3.1 安莎霉素种类及生物活性
        1.3.2 安莎霉素的生物合成研究概述
    1.4 论文设计思路
        1.4.1 选题背景
        1.4.2 选题目的及意义
第二章 活性向导下的实验菌株筛选
    2.1 研究背景
    2.2 实验材料
        2.2.1 生物材料
        2.2.2 培养基
        2.2.3 试剂及仪器
    2.3 实验方法
        2.3.1 实验菌株小试发酵
        2.3.2 实验菌株次级代谢产物分析
        2.3.3 实验菌株粗提物生物活性测试
    2.4 结果与讨论
        2.4.1 80株秦岭放线菌代谢产物分析
        2.4.2 实验菌株粗提物生物活性测试结果
    2.5 小结
第三章 胡克黑蛋巢菌CGMCC5.1116 化学成分及其生物活性研究
    3.1 研究背景
        3.1.1 蛋巢菌次级代谢产物研究现状
        3.1.2 化学表观遗传修饰策略
    3.2 实验材料
        3.2.1 菌株
        3.2.2 培养基
        3.2.3 主要试剂及试剂盒
        3.2.4 主要仪器、色谱耗材及生物材料
    3.3 实验方法
        3.3.1 目标菌株发酵条件筛选
        3.3.2 目标菌株放大培养
        3.3.3 次级代谢产物提取分离
        3.3.4 化合物3-16 的乳酸酯化
        3.3.5 化合物3-5 的水解反应
        3.3.6 生物活性测试
    3.4 结果与讨论
        3.4.1 菌株培养条件筛选的结果分析
        3.4.2 分离所得化合物的结构解析
        3.4.3 生物活性测试结果
    3.5 小结
第四章 胡克黑蛋巢菌CGMCC5.1116 化学成分衍生化及其生物活性研究
    4.1 研究背景
    4.2 实验材料
        4.2.1 实验仪器
        4.2.2 试剂与溶剂
    4.3 实验方法
        4.3.1 衍生路线
        4.3.2 生物活性测试
    4.4 结果与讨论
        4.4.1 衍生物结构表征
        4.4.2 衍生物生物活性评价结果
    4.5 小结
第五章 可可链霉菌阿苏亚种H2S5 化学成分及其生物活性研究
    5.1 研究背景
    5.2 实验材料
        5.2.1 菌株
        5.2.2 培养基
        5.2.3 主要试剂及试剂盒
        5.2.4 主要仪器、色谱耗材及生物材料
    5.3 实验方法
        5.3.1 目标菌株发酵条件筛选
        5.3.2 目标菌株放大培养
        5.3.3 次级代谢产物提取分离
        5.3.4 化合物5-4 的绝对构型测定
        5.3.5 化合物5-11 的水解和糖构型测定
        5.3.6 生物活性测试
    5.4 结果与讨论
        5.4.1 菌株培养条件筛选的结果分析
        5.4.2 分离所得化合物的结构解析
        5.4.4 生物活性测试结果
    5.5 小结
第六章 可可链霉菌阿苏亚种H2S5 基因组测序及其次级代谢潜能分析
    6.1 研究背景
    6.2 实验材料
        6.2.1 菌株
        6.2.2 培养基
        6.2.3 试剂及仪器
    6.3 实验方法
        6.3.1 总基因组的提取
        6.3.2 基因组测序、组装、序列分析
    6.4 结果与讨论
        6.4.1 可可链霉菌H2S5 基因组测序与分析
        6.4.2 tym与其它三烯霉素生物合成基因簇的对比分析
    6.5 小结
第七章 可可链霉菌阿苏亚种H2S5 菌株的遗传改造
    7.1 研究背景
    7.2 实验材料
        7.2.1 菌株、质粒与引物
        7.2.2 培养基
        7.2.3 试剂
        7.2.4 仪器
    7.3 实验方法
        7.3.1 可可链霉菌H2S5 粗产物中各化合物的标定
        7.3.2 化合物5-4 的产量测定
        7.3.3 分子生物学相关实验操作
    7.4 结果与讨论
        7.4.1 可可链霉菌H2S5 粗产物中各化合物的标定结果
        7.4.2 可可链霉菌H2S5 生产化合物5-4 的产量
        7.4.3 可可链霉菌H2S5 的抗生素敏感性
        7.4.4 可可链霉菌H2S5 产孢培养基的选择
        7.4.5 可可链霉菌H2S5 菌株与大肠杆菌接合转移实验方法和条件摸索
        7.4.6 可可链霉菌H2S5 菌株遗传操作设计
    7.5 小结
第八章 总结与展望
    8.1 工作总结
    8.2 创新点
    8.3 工作展望
        8.3.1 关于鸟巢烷型二萜
        8.3.2 关于三烯霉素
参考文献
附录
致谢
个人简历


本文编号：2846247