GTF高产酵母菌株YSI-3.7富铬机理的研究

发布时间：2020-10-18 19:54

　　 葡萄糖耐量因子(GTF)作为酵母富集Cr(Ⅲ)生成的产物,可以增强胰岛素的功能,促进糖、脂代谢,逆转葡萄糖耐受不良,提高糖耐量;保护胰岛素β细胞,并且增加胰岛素受体数量,提高亲和力等功能。由于酵母铬具有产量大,安全性高等优点而备受国内外科学家关注。但是,酵母富集Cr(Ⅲ)的机理却一直未被阐明。因此,本文以本实验室保藏的高产GTF酵母菌株YSI-3.7为研究对象,从酵母中铬的分布、酵母表面基团对酵母富铬的影响、酵母富铬过程中基因的表达以及酵母细胞生理过程中氧化应激指标的变化等方面进行了探究。在一定程度上阐明酵母富集Cr(Ⅲ)形成GTF机理,为GTF的工业化生产提供理论基础。主要结论如下:1.Cr3+浓度为500μg/m L时,YSI-3.7酵母细胞吸附的总铬(1803.87μg/g·dcw)和有机铬(1133.91μg/g·dcw)含量最高。通过EDTA螯合洗脱和酶解洗脱对酵母细胞组分进行分离,印证分析了铬在不同细胞部位的分布。细胞壁上富集的铬基本为无机铬,占菌体富集总铬的14.43%;原生质体中的铬占酵母富集总铬的85.57%,其中73.29%主要为有机铬。利用EDS能谱扫描及TOF-SIMS对酵母菌体进行横截面和深度剖析铬含量的分析表明铬在酵母细胞中呈均匀分布。2.对酵母细胞表面不同基团(氨基、羧基、磷酸基、酯基)分别进行化学屏蔽,结果表明酵母表面氨基、羧基和磷酸基团对酵母富铬量有较大影响。红外光谱分析结果也印证了上述结果。3.利用转录组学分析技术对空白酵母和富铬酵母菌体进行分析,分析RNA-Seq测序结果表明,空白组酵母和500μg/m L Cr3+培养的富铬酵母中共鉴定出共鉴定5987个基因,其中5796个基因在两组酵母中均被检测出来,2333个具有显著差异表达的基因。其中,有1273个基因表达上调,1060个基因下调。根据KEGG数据库进行注释归类,98条代谢途径发生了改变,其中对核糖体代谢、硫代谢、氧化压力代谢相关、碳代谢,半胱氨酸和蛋氨酸代谢等途径影响最大。根据GO数据库注释归类,分别为生物途径(778条途径)、细胞组分(173条途径)、分子功能(594条途径)三类;其中表达差异比较显著的基因主要有GSH2,SPE4,MET16,CYC1,MSN4等。4.铬浓度升高导致酵母细胞膜脂过氧化程度加重。在较低浓度(0~500μg/m L)的Cr3+作用下,酵母通过增加总抗氧化能力(T-AOC),还原型谷胱甘肽(GSH)、巯基含量和谷胱甘肽氧化酶(GSH-Px)活力等防御Cr3+的氧化胁迫。而细胞中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(CAT)活力在此过程中变化不明显。1 mmol/L Na2SO3可增加酵母细胞巯基、GSH、T-AOC含量,从而缓解铬对于酵母的胁迫作用,提高酵母的生物量和酵母细胞中有机铬和总铬的含量。
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TQ920.1
【部分图文】：

科学院硕士毕业论文 第二章 GTF 高产酵母菌体中铬（续养液中 Cr3+浓度μg/mL细胞干重g/100 mL有机铬μg/g dcw总铬μg/g·dcw有机铬/总（%）500 0.97 ±0.05 725.55 ±55.08 1255.53 ±43.75 57.74 ±2800 0.45 ±0.02 536.25 ±36.89 1812.22 ±38.24 29.62 ±2

图 2.4 不同浓度 Cr3+培养的酵母 YSI-3.7 菌体扫描电镜图Fig. 2.4 Scanning electron microscopy(SEM) of YSI-3.7 cultivated atvarious concentrations of Cr3+图 A 为 0 μg /mL Cr3+培养的 YSI-3.7（对照）；图 B 为 200 μg/mL Cr3+培养的 YSI-3.7；图 C 为 500 μg/mL Cr3+培养的 YSI-3.7；图 D 为 800 μg/mL Cr3+培养的 YSI-3.7。图 2.4 所示，未加 Cr3+培养的 YSI-3.7（图 A）形状是规则的椭圆形，立体形状饱满式为芽殖。在 200 μg/mL Cr3+胁迫下，酵母细胞表面没有显著变化，胞体上有多个此浓度下，酵母的出芽繁殖活动并没有受到显著影响。由酵母表面出现芽痕的数量断菌龄，而由上图看出，200 μg/mLCr3+胁迫下具有相同菌龄的 YSI-3.7 相对于空白状变长。Cr3+浓度增加（500 μg/mL）酵母细胞形状变得更长，且表面出现了沉淀，酵母细胞壁上富集。同样，800 μg/mLCr3+浓度时，酵母细胞形变加剧，表面富集更而，图中各个 Cr3+浓度条件下，YSI-3.7 细胞壁均未受到明显破坏，都有一个至多说明在上述 Cr3+浓度下，YSI-3.7 可以正常繁殖。生物对有害物质和环境改变有一定的适应性和抵抗力。环境中的重金属在低浓度时，因为这些金属是微生物细胞中的某些酶的必需成分；但当重金属含量超过其临界浓物具有毒性，甚至会杀死微生物（刘鹭，2009；叶锦韶，2002）。从富铬酵母扫描

图 2.5 不同浓度 Cr3+培养的酵母菌体透射电镜图Fig. 2.5 Transmission electron microscopy(TEM) of YSI-3.7 cultivated atvarious concentrations of Cr3+图 A 为 0 μg /mL Cr3+培养的 YSI-3.7（对照）；图 B 为 200 μg/mL Cr3+培养的 YSI-3.7；图 C 为 500 μg/mL Cr3+培养的 YSI-3.7；图 D 为 800 μg/mL Cr3+培养的 YSI-3.7。金属的生理作用或毒害作用必须以进入细胞内为前提。大部分细胞可采用快速吸收类重金属离子吸收系统（Nies et al., 1999）。快速吸收通常仅靠化学渗透离子梯度或消耗降低低能量，缓慢吸收则需要借助 ATP 水解作为能量或化学渗透梯度，需要耗费射电镜对铬胁迫下的酵母细胞进行观察。如图 2.5 所示，未加 Cr3+处理的 YSI-3.7的椭圆形，并且锇酸染色比较均匀，细胞核较小，线粒体沿着细胞轮廓均匀地排布；200 μg/mL Cr3+处理的 YSI-3.7 也是呈椭圆形，但是细胞稍微拉长，细胞核变大周围出现白色空泡。此时，进入酵母的铬对于酵母内部没有产生可见的破坏；当 C 500 μg/mL 和 800 μg/mL 时，细胞变成了更细长的无规则的形状，并且细胞核中出更大。随着 Cr3+浓度的升高，YSI-3.7 细胞的形状变长，细胞壁逐渐变薄，并且内数目越来越多，破坏主要集中在细胞核上，细胞核更容易被高浓度的铬破坏。推测性（核孔 40～70 nm）比其它生物膜大有关。当环境中存在低浓度 Cr3+，微生物可3+3+3+
【参考文献】

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本文编号：2846741