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牡丹籽油抗炎作用的分子机理研究

发布时间:2020-10-19 10:28
   牡丹籽油(peony seed oil,PSO)属于新食品资源,被专家评为优质食用油,是从牡丹籽中提炼的金黄色透明液态油。不饱和脂肪酸是PSO中最重要的活性成分,其中亚麻酸的含量所占比例为60%。研究表明PSO具有许多生理功能,最近研究显示PSO可能具有抗炎生物活性,但其具体抗炎功能分子机制尚无文献报道。本实验研究利用细胞和动物炎症模型:葡聚糖硫酸钠(sodium dextran sulfate,DSS)诱导ICR小鼠构建体内炎症模型和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激RAW264.7巨噬细胞构成体外炎症模型,共同对PSO抗炎功能进行评估及对抗炎作用的分子机理进行初步探究。实验结果为牡丹籽深加工及牡丹籽油保健食品的开发提供参考。实验观察发现:PSO干预组小鼠比DSS组精神状态明显好转,便稀、便血小鼠数量减少或无,结直肠病变程度减轻,疾病活动指数(disease activity index,DAI)评分降低趋势显著。使用苏木精-伊红染色法(hematoxylineosin staining,HE)检测小鼠结肠组织病变情况,显微镜下采集图片分析比较可知,DSS组小鼠病变情况如下:黏膜大面积糜烂,腺体隐窝结构完整性破坏较严重,有大量的炎性细胞如淋巴细胞及伴中性粒细胞等浸润,杯状细胞数量显著减少,呈现出溃疡性结肠炎症状;而PSO干预组小鼠结肠出血较少,炎性细胞有少量浸润,结肠黏膜糜烂状况减轻,隐窝结构排列较为整齐、形态较为完整。通过测定小鼠血浆中组织损伤因子髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、丙二醛(malondialdehyde,MDA),发现DSS组中MPO和MDA和分别升高为对照组的3.5和3.2倍。同时也发现小鼠结肠组织损伤炎症介质一氧化氮(nitrite/nitrate,NO)含量升高了4.2倍;相比于DSS组,PSO组MPO、MDA和NO含量分别降低了 20%、26%和22%。从生化指标的角度,发现PSO能减少DSS诱导的小鼠损伤。荧光实时定量PCR技术(real time-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)和蛋白质免疫印迹技术(westernblotting,WB)检测发现,与对照组相比,DSS组小鼠结肠组织中环氧化合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-lβ,IL-1β)和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的mRNA表达水平显著升高,而PSO组相比于DSS组分别下降53.6%、41.0%、50.6%和54.2%。WB实验进一步证实了这些炎性细胞因子蛋白质表达水平有相似结果。检测结肠组织中丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信号通路关键靶基因的磷酸化表达情况。DSS组细胞外调节蛋白激酶1/2 的磷酸化(phosphorylation of extracellular regulated protein kinases1/2、p-ERK1/2)、c-Jun 氨基末端激酶的磷酸化(phosphorylation of c-Jun N-terminal kinase,p-JNK)和p-p38蛋白质表达量为对照组的 1.48±0.23、1.88±0.24、3.21±0.45倍。PSO组分别为对照组的 1.23±0.15、1.45±0.25和1.48±0.34倍。结果显示PSO能抑制MAPK信号通路的活化,可能与其抑制炎症因子表达相关。体外实验中通过噻唑兰(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphe nyltetrazolium bromide,MTS)法检测PSO对RAW264.7细胞毒性影响。结果显示PSO各组与对照组OD值无明显差异。说明0~400μg/mLPSO溶液对RAW264.7细胞的生长、状态及活力无影响,证明对细胞无毒性,可用于后续实验研究。LPS组细胞COX-2、TNF-α、IL-1β和iNOS炎症因子mRNA表达量为对照组的5.66、7.59、6.78和2.62倍;而PSO 25 μg/mL、50 μg/mL和 100 μg/mL三组与LPS组相比,均呈剂量依赖性显著降低。蛋白表达量有相似结果。采用荧光素酶报告基因技术检测炎性细胞中炎症相关的核转录因子转录活性。相比于对照组,LPS模型组细胞AP-1/c-Jun(activatorprotein-1)与NF-κB/p65(nuclear transcription factor-κB)相对荧光素酶活性(RLU)分别增加了 1.89倍和2.22倍,而PSO各组细胞中AP-1与NF-κB的RLU值呈剂量依赖性减少,分别减少了 32.3%、39.2%、47.1%和36.9%、43.7%、55.4%。c-Jun和p65蛋白在胞浆与胞核中的变化情况如下:相比于对照组,LPS组胞核与胞浆中c-Jun和p65蛋白表达量趋势相反,在胞核中均增加,而胞浆中均下降;相比于LPS组细胞,PSO组胞核中和胞浆中c-Jun蛋白表达量逐渐增加,而p65蛋白表达量显著降低,且呈剂量依赖性。因此,PSO可显著抑制炎症细胞胞浆胞核中c-Jun、p65的移位作用,可使AP-1、NF-κB转录活性降低。对细胞中MAPKs通路关键靶基因的磷酸化激活水平的检测,结果表明PSO组p-ERK1/2、p-JNK、p-p38蛋白表达量相比LPS组下降,说明PSO可能通过调节MAPKs关键靶基因磷酸化的激活抑制炎症的产生。LPS诱导的RAW264.7细胞中,加入MAPKs通路靶基因的抑制剂处理,利用WB技术检测各组细胞中促炎因子IL-1β表达量,以及MAPKs关键靶基因的磷酸化激活情况。由结果可知,与LPS诱导组相比,在PSO与MAPKs抑制剂共同作用下,细胞中炎症因子IL-1β表达水平及MAPKs关键靶基因中p-ERK1/2、p-JNK、p-p38的蛋白表达水平显著减少。说明在MAPK磷酸化作用被阻断的情况下,PSO可与抑制剂发生协同作用抑制炎症因子的表达从而发挥抗炎功效。综上所述可知,在体内实验中,从动物整体水平上PSO能有效改善DSS诱导小鼠结肠炎症的宏观表型,降低DAI,缓解结肠组织病理损伤;降低结肠组织中MPO、MDA含量和血清中NO含量;抑制结肠组织中COX-2、TNF-α、IL-1β和iNOS等促炎基因的高表达;减少结肠组织中p38、JNK及ERK1/2的磷酸化水平。在体外实验中,从细胞整体水平上PSO可下调LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子COX-2、TNF-α、IL-1β和iNOS基因的过表达;抑制炎症相关转录因子(如NF-κB、AP-1)在胞浆胞核间的变化情况及转录活性;减少MAPKs中p38、JNK及ERK1/2的磷酸化程度。另外,在PSO存在的情况下,添加MAPKs抑制剂可进一步抑制MAPKs中p38、JNK及ERK1/2磷酸化水平以及炎症因子IL-1β的表达。提示PSO抗炎机理的分子机制,与通过抑制结肠组织和细胞中MAPKs信号通路,以及抑制细胞中核转录因子从而减少炎症因子的表达有关。
【学位单位】:中南林业科技大学
【学位级别】:硕士
【学位年份】:2019
【中图分类】:TS221
【部分图文】:

籽油,小鼠,牡丹,灌胃


症模型。在实验过程中,观察小鼠并在指定的时间点记录总的自由饮用2.0%DSS水溶液后,前几日每组间小鼠的状态无显天,DSS损伤组小鼠表现出体重减轻、精神萎靡、食物和水少、便稀甚至便血和其他典型的IBD样结肠炎症状。初步判功。牡丹籽油灌胃组(500mg/kg/天)的DSS诱导的小鼠以上显减轻。饮用DSS水至第6天时,DSS损伤组体重从35.77?±?0?±?1.08?g,而对照组和牡丹籽油保护组的小鼠体重均处于缓第九天,牡丹籽油灌胃组的DSS诱导小鼠体重出现便稀现象,现缓慢下降的趋势。在实验结束时,各组间小鼠的平均体重情:39.04?±0.65?g,?DSS?组:30.23?±0.58?g,?PSO?保护组:33.44?保护组小鼠体重与DSS损伤组呈现显著性差异。0<〇.〇5、户<45.0??

腹泻率,小鼠,结肠炎


Tiine(d)??时间(天)??图2-2?DSS诱导结肠炎DAI评分??Fig.?2-2?DAI?score?in?DSS?induced?colitis?among?the?three?groups??注:与DSS组比较,*户<?0.05??实验结束后,DSS组中95%的小鼠具有不同程度的腹泻,保护组降低至75%??(图?2-3)。??*本??I?I??100?r??90.?閱??80?XX\??^?70?XXX?冃??si60?tv?m??if?S?"°?III?—??睞?40?tti?=??鹎?^?3。?xv?m??20?Xii?=??10?tti??o'?^??Control?DSS?DSS+PSO??图2-3小鼠腹泻率??Fig.?2-3?Diarrhea?rate?of?mice?among?three?groups??注:与DSS组比较,**;?<?0.01??26??

结肠炎,腹泻率,小鼠


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本文编号:2847087

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