黑曲霉高耐热葡聚糖酶基因克隆及其在毕赤酵母中高表达方法探索

发布时间：2020-10-21 07:30

　　 β-葡聚糖酶能够水解大麦等谷物中β-葡聚糖,在啤酒酿造及饲料工业中用于β-葡聚糖的降解以降低粘度改善生产工艺及产品性能。在啤酒酿造中,β-葡聚糖酶主要在糖化阶段使用,因此需要耐受糖化阶段的高温酸性环境。在饲料工业中,β-葡聚糖酶虽然主要在动物肠道的中性环境中发挥作用,但需要耐受饲料造粒阶段的高温环境及动物胃部的酸性环境。目前工业应用的β-葡聚糖酶对高温和酸性环境的耐受力尚不能充分满足工业应用的要求,耐热性和耐酸性水平更高的β-葡聚糖酶具有一定的工业应用前景。本文主要利用黑曲霉基因组信息,从黑曲霉中克隆并鉴定具有更高耐热性的β-葡聚糖酶编码基因,进一步采用高拷贝整合等方法,探索构建β-葡聚糖酶高表达重组毕赤酵母的方法。论文的主要结果如下:(1)以黑曲霉(A.niger CBS 513.88)基因组信息为依据设计引物,通过RT-PCR技术,逐个克隆黑曲霉(A.niger CICIM F0510)基因组中可能编码葡聚糖酶的基因,在毕赤酵母中诱导表达,鉴定重组酶性质。鉴定获得一种新型耐热性的葡聚糖酶编码基因eglA6,其所编码的重组酶AnEglA6的耐热性和耐酸性明显超过黑曲霉中已发现的葡聚糖酶。(2)根据巴斯德毕赤酵母的密码子偏好性对eglA6基因进行优化,密码子优化后的基因命名为eglA6b,在毕赤酵母中表达eglA6b基因,经过密码子优化后葡聚糖酶的表达量提高了1.8倍。重组酶AnEglA6的最适温度为75℃,最适pH为4.0,表观分子量约为52 kDa。以大麦葡聚糖为底物时,重组酶AnEglA6比酶活为12450.6 U·mg~(-1),K_m和V_(max)分别为19.1 mg·m L~(-1)和5.9 mmol·min~(-1)·mg~(-1);以CMC-Na为底物时,比酶活为1645.7 U·mg~(-1),K_m和V_(max)分别为43.1 mg·m L~(-1)和2.6 mmol·min~(-1)·mg~(-1);以地衣多糖和燕麦葡聚糖为底物时,AnEglA6比酶活分别为17445.2 U·mg~(-1)和12004.1 U·mg~(-1)。在70℃和75℃下酶活半衰期分别为4.6 h和1.9 h。Co~(2+)、Mn~(2+)对酶活有一定的促进作用,Fe~(3+)对酶活有较明显的抑制作用。(3)采用两步同源重组技术,依次删除毕赤酵母高表达菌株Pichia pastoris GS115/pPIC9K-eglA6b HB133的URA3、TRP1基因,构建了URA3单缺失菌株和URA3、TRP1双缺失菌株,同时分别以URA3、TRP1基因作为筛选标记,构建葡聚糖酶基因表达盒pPIC9K-eglA6b-TRP1及pPIC9K-eglA6b-URA3,依次转化后得到高表达菌株Pichia pastoris GS115/pPIC9K-eglA6b HB133 S6,与出发菌株HB133相比,酶活提高了12.1%。(4)分别在摇瓶水平和5 L发酵罐水平对重组菌Pichia pastoris GS115/pPIC9K-eglA6b HB133 S6发酵条件进行了优化。摇瓶条件下,当初始pH为6.0,甲醇添加量为1.5%,葡聚糖酶的酶活达到最高3603.9 U·mL~(-1)。5 L发酵罐条件下,经优化后,当发酵罐pH为4.5,菌体浓度OD_(600)为360,以10 m L·h~(-1)·L~(-1)的速度补加甲醇,重组菌产葡聚糖酶酶活达到最高33031.8 U·mL~(-1),是摇瓶条件下的9.17倍。本文获得了一种在酸热条件下具有较高稳定性和活性的重组葡聚糖酶AnEglA6,并构建了一株高表达AnEglA6的重组巴斯德毕赤酵母。AnEglA6在饲料、啤酒工业及其它在高温酸性条件进行的生物加工工艺中有一定的应用前景。
【学位单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TQ925
【部分图文】：

在毕赤酵母中的表达白在 N 端均有一段信号增基因的成熟肽编码区并、Peg10 扩增基因 eglA6 达载体 pPIC9K-eglA6 和性化表达载体 pPIC9K-e30℃培养，直至出现转化30℃、200r·min-1条件下中诱导，120h 后结束诱图中可以看出，pPIC9K间，转化子平均酶活为 6葡聚糖酶 cDNA 基因的 RT-PPCR of the glucanase gene eglr；1：葡聚糖酶基因 eglA6；

(a) (b)图 3-2 重组质粒 pPIC9K-eglA6(a)和 pPIC9K-eglA8(b)转化子酶活Fig. 3-2 Enzyme activity of recombinant Pichia pastoris GS115/pPIC9K-eglA6 and Pichia pastorisGS115/pPIC9K-eglA8将获得的葡聚糖酶粗酶液进行 SDS-PAGE 电泳，结果如图 3-3 所示，两种葡聚糖酶基因均成功在毕赤酵母中实现了较高水平的表达。

18聚糖酶的 SDS-PAGE 鉴定alysis of the recombinant AnEPichia pastoris GS115/pPICS115/pPIC9K-eglA8 cultur与重组酶的纯化根据巴斯德毕赤酵母的名为 eglA6b，其序列已体 pPIC9K 连接，获得重随机挑选其中 20 个转，14 个转化子表现出较lA6 的转化子平均酶活为
【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 孙军涛;肖付刚;王洪新;吕文平;;耐热β-1,3-1,4-葡聚糖酶的分子改造研究进展[J];世界科技研究与发展;2013年02期

2 唐艳斌;闫巧娟;江正强;杨绍青;杜雪丹;;枯草芽孢杆菌产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的响应面优化[J];微生物学通报;2013年04期

3 杨树奎;;β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶在农作物病虫害防治中的研究进展的几点思考[J];中国农业信息;2013年15期

4 陈玉娟;沈微;陈献忠;王正祥;;解淀粉芽孢杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶的高效表达[J];生物技术;2011年02期

5 熊云霞;赵旭;郑必胜;;裂褶菌发酵产β-1,3-葡聚糖酶条件的优化[J];现代食品科技;2011年06期

6 孙军涛;王洪新;吕文平;马朝阳;娄在祥;戴易兴;;耐热β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆、表达及其酶学特性[J];江苏农业学报;2011年04期

7 李伟;李丽莉;宋月;金桥;佟长青;张彦龙;;扇贝消化腺β-1,3-葡聚糖酶的分离和性质研究[J];食品工业科技;2010年08期

8 王廷璞;马静静;赵菲佚;;β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶在农作物病虫害防治中的研究进展[J];安徽农业科学;2010年26期

9 杜济良;赵洪亮;薛冲;任敏;刘志敏;;不同信号肽对胞外β-(1,3)-葡聚糖酶在巴斯德毕赤酵母中表达的影响[J];生物技术通讯;2010年06期

10 左豫虎;杨传平;郑耀;娄树宝;;大豆疫霉菌诱导的β-1,3-葡聚糖酶与寄主抗病性的关系[J];大豆科学;2009年05期

相关博士学位论文 前10条

1 李华;嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophilium）热稳定性β-1，3-葡聚糖酶的纯化特性及cDNA克隆[D];山东农业大学;2008年

2 魏琴;麻疯树（Jatropha curcas）种子抗真菌蛋白及相关基因的分离、表达研究[D];四川大学;2004年

3 李燕红;福寿螺（Ampullaria crossean）内切-β-1，4葡聚糖酶的研究[D];中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）;2005年

4 秦臻;β-1,3-葡聚糖酶和β-1,3-糖基转移酶的结构与功能研究[D];中国农业大学;2016年

5 王广金;葡聚糖酶基因、高分子量谷蛋白优质亚基基因转化小麦的研究[D];东北农业大学;2002年

6 程瑞;索拉胶降解菌产葡聚糖酶的研究[D];南京理工大学;2014年

7 鲁健章;共表达β-1,3-1,4-葡聚糖酶和β-1,4-木聚糖酶重组酿酒酵母的构建及其性能的应用研究[D];浙江大学;2014年

8 徐欣欣;特异腐质霉高效表达体系的建立及新型葡聚糖酶的功能鉴定[D];中国农业科学院;2016年

9 彭莹;土星拟威尔酵母WC91-2菌株嗜杀因子和β-1，3-葡聚糖酶的研究[D];中国海洋大学;2010年

10 刘博;条锈菌诱导的小麦β-1，3-葡聚糖酶基因的表达特征分析及条锈菌基因功能验证体系建立的探索[D];西北农林科技大学;2010年

相关硕士学位论文 前10条

1 韩冰;黑曲霉高耐热葡聚糖酶基因克隆及其在毕赤酵母中高表达方法探索[D];江南大学;2018年

2 赵玥;毕赤酵母中内切β-1,3葡聚糖酶的表达及水解生产热凝胶寡糖[D];江南大学;2018年

3 孔祥鹏;棘孢木霉葡聚糖酶基因Glu功能研究[D];东北林业大学;2017年

4 宫国君;鲍鱼内脏β-1,3-葡聚糖酶的分离纯化及性质研究[D];大连工业大学;2011年

5 高轩;茶树β-1，3-葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达与其抗真菌研究[D];安徽农业大学;2007年

6 唐治玉;木霉β-1，3-葡聚糖酶的分离纯化、性质和部分结构研究[D];华中农业大学;2006年

7 黎柳君;青稞β-1，3-葡聚糖酶的纯化、性质及抗体制备[D];四川大学;2006年

8 刘博;条锈菌诱导的小麦β-1，3-葡聚糖酶基因编码区的克隆与原核表达[D];西北农林科技大学;2006年

9 陈计;β-1,3-1,4-葡聚糖酶高产菌诱变选育及酶的定向进化研究[D];南京农业大学;2014年

10 刘琼;Thermotoga neapolitana β-1，3-葡聚糖酶基因的克隆与表达[D];吉林农业大学;2013年

本文编号：2849830