一株野生马鞍菌的分类鉴定、人工栽培及发酵工艺研究

发布时间：2020-10-21 07:37

　　 食用蕈菌味道鲜美,营养价值丰富,开发和利用野生食用蕈菌资源,对丰富野生食用蕈菌种质资源库意义重大,是蕈菌产业发展的关键。本课题运用形态学观察结合内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer,ITS)基因测序的方法对野外采集到的疑似野生马鞍菌X1菌株进行了分类鉴定;测定了该菌子实体的主要营养成分;采用电感耦合等离子体原子发射光谱法(Inductively Coupled Plasma-Atomic Emission Spectrometry,ICP-AES)对其子实体矿物质进行了检测;采用气相色谱-质谱(Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS)联用技术对其子实体挥发性成分进行了定性和定量分析;以DPPH·和ABTS~+·清除能力为指标,以BHT作为阳性对照,测定了子实体粗多糖的体外抗氧化活性;对其子实体粗提物进行了急性毒理试验;在此基础上,对其菌丝体的生物学特性进行了探究,设计了人工栽培试验;并采用Illumina Miseq高通量测序技术对该菌子实体根际土壤真菌群落组成及多样性进行了分析;最后对其菌丝体进行了液态和固态发酵研究。主要研究结果如下:(1)运用形态学观察与分子生物学技术相结合的方法,确定了X1菌株的分类地位。结果显示:X1菌株隶属子囊菌门(Ascomyzcota)盘菌纲(Pezizomycetes)盘菌目(Pezizales)马鞍菌科(Helvellaceae)马鞍菌属(Helvella),拉丁文学名为Helvella lacunosa,中文名称为棱柄马鞍菌,异名多洼马鞍菌。(2)对棱柄马鞍菌子实体的主要营养成分进行了测定,结果表明:该菌子实体粗蛋白含量达23.72%,粗脂肪含量达3.65%,粗纤维含量达55.12%;子实体中共检测到17种氨基酸,包括人体所必需的8种氨基酸,必需氨基酸含量是非必需氨基酸含量的0.64倍,且鲜味氨基酸(Asp、Glu、Gly和Ala)占氨基酸总量的30.07%;采用ICP-AES法对子实体的16种矿质元素进行了检测,结果表明:子实体含有丰富的矿质元素,其中Fe、Zn、K、Na、Ca、Mn、Cu及Mg的含量分别为0.114μg/g、0.017μg/g、2.13μg/g、0.13μg/g、0.0046μg/g、0.0053μg/g、0.0032μg/g、0.1005μg/g,重金属只检出As和Sb,含量分别为0.0021μg/g和0.0013μg/g,均低于国家食品标准规定的0.1μg/g的限量要求;采用GC-MS法对子实体的挥发性成分进行分析,共检测到122种化合物,确定结构39种,占总挥发性成分的81.5%,其中相对含量较高的己醛、己酸、乙酸和2-戊基呋喃是国家规定允许使用的食用香料,是调香原料不可缺少的物质;以DPPH·和ABTS~+·清除能力为指标,测定了子实体粗多糖的体外抗氧化活性,结果表明:该菌子实体粗多糖具有较强的抗氧化性,当浓度为10mg/mL时,对DPPH·和ABTS~+·的清除率分别达到49.18%和53.33%;由子实体粗提物急性毒理试验结果可知,用药组最大给药剂量达0.4mL/10g.bw时,实验小鼠生存状况良好,未出现明显的致毒反应,且14d内实验小鼠全部存活,处死解剖后的小鼠脏腑器官未见明显的病理改变。根据食品安全国家标准,可以认定棱柄马鞍菌是安全无毒的。由此可见,该野生菌不但营养丰富,味道鲜美,且无毒性,是一种值得开发利用的蕈菌。(3)以PDA培养基为基础培养基,利用平板培养的方法初步研究了X1菌株的生物学特性,研究结果表明:X1菌株菌丝体生长的最佳碳源为葡萄糖、氮源为酵母浸膏、无机盐为MgSO_4;最佳培养温度为25℃,适宜pH为6.5,适宜光照条件为12h黑暗+12h光照。人工栽培X1菌株试验结果表明:X1菌株最适宜的原种培养基为松木屑+麸皮煮汁琼脂培养基;最佳母种培养基为松木屑+麦粒培养基;最适宜的栽培料配方是松木屑+棉籽壳,X1菌丝体在该培养料上长势好,65d满袋,平均生长速度达4.32±1.54mm/d,子实体直径0.3–1.6cm,菌盖淡褐色,菌柄灰白色,其长度、直径分别达0.3–3.12cm和0.5–1.5cm;子实体产量和生物学效率分别为23.24g/袋和4.56%。(4)采用Illumina MiSeq高通量测序技术结合生物信息学对棱柄马鞍菌子实体根际土壤真菌群落组成及多样性进行了分析,结果表明:5个样本之间共有分类操作单元(Operational Taxonomic Unit,OTU)182个,样本5中特有OTU最多,为201个,样本1中特有OTU最少,仅59个。样本5和样本2种群丰度高于其余3个样本(P0.05)。样本1中特有的真菌属有Halokirschsteiniothelia;样本2中特有的真菌属有Plectania、Heydenia、Trichosporon、Clavaria,Thelonectria、Leucoglossum、Lepiota、Tricholoma;样本3中特有的真菌属有Metarhizium、Ceratocystis、Cadophora、Cercophora、Podospora;样本4中特有的真菌属有Hypxylon、Physciella、Cyphellophora、Phyragmocephala、Alternaria、Guttulispora、Ophiostoma、Tomentella、Caluatia、Thermomyces、Auxarthron、Botrytis、Scleromitrula、Schizothecium、Chaetomium、Glomerella、Acremonium、Cosllarina;样本5中特有的真菌属有Hirsutella、Porormia、Pseudodictyosporium、Lophiotrema。5个样本中优势菌群均属于子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)和接合菌门(Zygomycota),以上菌群在5个样本中的分布存在差异,但相对含量均大于5%。本实验结果说明,不同采样地棱柄马鞍菌根际土壤真菌多样性和物种丰度差异明显(P0.05),没有子实体生长的土壤,其真菌多样性高于生长过棱柄马鞍菌的土壤,且不同土壤样本中优势菌属种类与丰度不一样,可见棱柄马鞍菌对于根际定殖真菌具有一定选择性。(5)以液态发酵基础培养基为对照,以菌丝体生物量和胞外多糖(Exopolysaccharides,EPS)含量作为评价指标,通过单因素试验与响应面法对X1菌株液体摇瓶发酵过程中最适碳氮源以及添加量进行了优化。研究结果表明,当发酵配方为:1000mL马铃薯和松针煮汁、28.58g葡萄糖、2.77g蛋白胨、3.01g酵母浸膏、1g KH_2PO_4、1g NaHCO_3、0.5g MgSO_4和0.01g维生素B_1时,X1菌株的菌丝体生物量最高,可达11.01g/L,是对照组的8.83倍;当发酵配方为:1000mL马铃薯和松针煮汁、28.49g/L葡萄糖、3.54g蛋白胨、3.85g酵母浸膏、1g KH_2PO_4、0.5g MgSO_4和0.01g维生素B_1时,EPS含量最高,可达233.25mg/L,是对照组的4.06倍。在此基础上,采用正交试验对其菌丝体液态培养条件进行了优化,得出X1菌株的最佳液态培养条件为:接种量20%,装液量80mL,转速140r/min。经验证试验得出,在优化后的发酵工艺下,X1菌株的菌丝体生物量和EPS含量可高达11.86g/L和244.56mg/L,分别是对照组的9.59和4.31倍。(6)以X1菌株为发酵菌株,以山西常见的10种谷物(小麦、大米、燕麦、玉米、小米、藜麦、荞麦、大豆、豌豆和高粱)为发酵基质,对比研究了X1菌株通过固态发酵对发酵基质总酚含量和抗氧化性能的影响。结果表明,经X1菌株固态发酵后,小米、燕麦、藜麦、小麦和大豆发酵产物的总酚含量与发酵时间呈现出较显著的正相关性,相关系数(R)分别为0.930、0.898、0.911、0.764和0.770。发酵35d后,5种发酵谷物的总酚含量达到最大值:3.38mg/g、3.30mg/g、1.30mg/g、3.06mg/g和0.57mg/g,分别比对照高1.57、2.21、1.86、2.03和1.10倍。大米、荞麦和豌豆发酵产物的总酚含量与发酵时间呈正相关(R分别为0.435、0.398和0.132);玉米和高粱发酵产物的总酚含量与发酵时间呈负相关(R=-0.399和-0.723)。发酵7d后,玉米发酵产物总酚含量的最大值为3.18mg/g,比对照低0.3%;高粱发酵产物的总酚含量最大值为2.68mg/g,比对照低12%。以DPPH·清除能力、还原力、O_2~-·清除能力和Fe~(2+)螯合能力为指标,对发酵产物进行体外抗氧化性能分析,结果表明,10种谷物发酵产物中,小麦发酵产物提取物的DPPH·清除能力最强,EC_(50)值为0.16mg/mL,比对照组降低了98.78%;豌豆发酵产物提取物的还原力最强,EC_(50)值为4.18mg/mL,比对照组降低了56.56%;小米发酵产物提取物的Fe~(2+)螯合能力最强,EC_(50)值达16.64mg/mL,比对照组降低了81.61%;高粱发酵产物提取物的O_2~-·清除能力最强,EC_(50)值为12.41mg/mL,比对照组降低了53.82%。本实验结果表明,X1菌株固态发酵可以有效改善发酵基质的总酚含量和抗氧化性能。本研究结果表明,棱柄马鞍菌不仅子实体营养丰富,含有多种氨基酸和微量元素,其菌丝体的固态发酵还可以有效改善发酵基质的抗氧化性能,因而,本研究既可以为开发利用棱柄马鞍菌菌株提供理论依据,还可以为开发谷物抗氧化产品或功能食品提供科学指导。
【学位单位】：山西大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S646.11;TQ920.6;TS219
【部分图文】：

分类上绝大多数属于担子菌门，如双孢蘑菇（Agaricudodes）和黑木耳（Auricularia auricula）等；少数属于子lla esculenta）、蛹虫草（Cordyceps militaris）和马鞍菌（H子实体由两部分组成，分别是菌盖和菌柄，如图 1.1 所

图 1.3 蕈菌 rDNA 的结构[33]Fig 1.3 The structure of rDNA in mushroomsParnmen 等[36]采用 ITS 鉴定法对冷冻干燥的蕈菌子实体进行了分类鉴定。

图 1.4 中国驯化的野生食药用菌数量在世界总量中所占的比例Fig 1.4 The proportion of wild edible and medical fungus domesticated of China in the World中国地大物博，蕈菌数量更是遥居世界首位，但已经实现人工栽培的种类仅占
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本文编号：2849837