具有酯化活性脂肪酶TglE的生化特征分析

发布时间：2020-10-23 17:49

　　 具有酯化活性的脂肪酶在化妆品行业、生物柴油、食品行业和精细化工等酶法制造中具有极其重要的应用价值。为了满足工业生产的需求,寻找酯化活性脂肪酶为工业生产所急需。本文克隆了黑曲霉脂肪酶基因并在毕赤酵母中进行表达,进一步解析其酶学性质及其酯化活性。获得如下主要结果:从黑曲霉F0215中,成功扩增脂肪酶基因tglE,大小为801bp,编码266个氨基酸残基,预测分子量为28kDa。通过模拟蛋白结构分析,Ser139、Asp195、His248为其催化中心氨基酸残基组成;成功构建了重组毕赤酵母菌株GS115-tglE;摇瓶水平上,TglE的发酵液酶活达到32.88 U/mL;进一步摇瓶发酵制备酶液并进行纯化,经过硫酸铵盐析、PD-10除盐、凝胶柱层析纯化,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,分子量大小约为32 kDa,比酶活为137.08 U/mg,纯化倍数为13.95,得率为13.36%。对纯化后的脂肪酶TglE进行酶学性质分析表明,脂肪酶的最适作用温度为40℃,最适作用pH为7.0,在20-30℃和pH6.0-8.0条件下具有良好的稳定性;Cu2+、Mrn2+、Ca2+、K+、Mg2+、Sn2+、二甲基亚砜、甲醇和庚烷对脂肪酶TglE的水解活性有促进作用,Ca2+和庚烷的促进作用较明显;Fe3+、Zn2+、EDTA、乙酸甲酯和十二烷对脂肪酶TglE的活性有抑制作用,其中金属离子螯合剂EDTA和十二烷的抑制作用较明显;脂肪酶对C4底物的作用最强,对C16底物的作用最弱,为以C4为底物的30.96%;它对橄榄油的作用最强,对棕果油的作用最弱,为以橄榄油为底物的45.45%;动力学常数的研究表明,脂肪酶TglE的Km值为14.40 mmol/L,V/Lx为46.72 mmol/(L·h)。确认了脂肪酶TglE具有酯化活性。通过气相色谱分析,脂肪酶在以十二烷为溶剂,反应体系中酸浓度为0.3 mol/L,辛酸与乙醇摩尔比为1:2.4的条件下,12 h催化辛酸和乙醇酯化的转化率为36.84%。本文成功将黑曲霉脂肪酶基因在毕赤酵母中克隆表达,系统研究了其酶学性质及酯化活性,为其在工业中应用做出初步探索。
【学位单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TQ925.6
【部分图文】：

，。浓度测定方５去??ＣＡ蛋白浓度测定试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），按照试酶酶活测定方法??标碱滴定法??标?ＧＢ／Ｔ?２３５３５－２００９１８５】??义：１?ｇ固体酶粉（或１?ｍＬ液体酶），在一定温度和ｐＨ条件，叩１〇１的可滴定的脂肪酸，即为１个酶活力单位，以Ｕ／ｇ（Ｕ／ｍＬ）硝基苯酚法??献报道，对硝基苯酚法测定脂肪酶酶活方法如下［８６１：??曲线绘制??０１?ｍＭ、０．０２?ｍＭ、０．０３?ｍＭ、０．０４?ｍＭ、０．０６?ｍＭ、０．０８?ｍＭ?的，分别在４１０?ｎｍ下测定吸收值，绘制标准曲线，如下图。??

根据网上注释信息，这沉基因序列全长为８６１?ｂｐ，编码氨基酸个数为２８６个。在??丹麦技术大学生物序列分析中心（ＣＢＳ?）的网站（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ?），??通过ＳｉｇｎａｌＰ平台对其编码的氨基酸序列信号肽切割位点进行预测，结果如图３－１。从??信号肽预测结果来看，这沉基因编码的氨基酸序列的Ｎ末端包含一个典型的信号肽序??列（ｌ－２０ａｖ），信号肽切割位点为：ＬＡＶ－ＰＭ。设计引物时去除编码信号肽的序列。??９ｇｎａｌＰ－４?１?ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ?（ｅｕｋ?ｎｅｔｗｏｒｋｓ）?Ｓｅｑｕｅｎｃｅ??￣?Ｇｓｃｏｒｅ＇??１?０?Ｓｓｃｏｒｅ???？??Ｙ－ｓｃｏｒｅ????０?８??，．?ｊ?：??１。４．—一．??０?２?？??ａ。川丨丨｜丨丨｜丨丨丨丨丨丨丨｜｜丨｜?ｉｉｉｉｉｉｉ?ｉｌｍｎｉｉｆｆｌｉｎＭＭｉｉ??ＭＲＶＧＫＳＴ?ＬＦＧＧＬＡＬＴ?ＰＩＴ?ＵＶ?ＭＨＯＳＲＡＴＳＯＰＡＥＷＴ?ＥＬＨＲＡＡＯｌＳＳＡＡ?ＹＴＱＣＴ６ＳＡ?ＦＤＶＴ?ＩＴ?ＫＯＩ?ＩＩＥＩＶ１??０?１０?２０?３０?４０?５０?６０?７０??Ｐｏｓｉｔｉｏｎ??图３－１吃／￡蛋白信号肽序列预测结果??Ｆｉｇ．?３－１?Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ?ｏｆ?Ｓｉｇｎａｌ?ｐｅｐｔｉｄｅ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?ｏｆ?ｔｌｇＥ?ｐｒｏｔｅｉｎ??３．２脂肪酶基因这／￡的克隆??３．２．１?Ａｓ＾ｅｒｇ７’／／ｕｓ?厂?Ｆ０２１５?总?ＲＮＡ?的提取??按照２．２．２．１中方法提取黑曲霉Ｆ０２１５总ＲＮＡ

１?２??ＥＳＫ３—１８Ｓ??图３－２黑曲霉Ｆ０２１５总ＲＮＡ电泳结果??Ｆｉｇ．?３－２?Ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｏｆ?ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ?ｏｆ?Ａ．?ｎｉｇｅｒ?Ｆ０２１５??１，２均为黑曲霉总ＲＮＡ??３．２．２脂肪酶基因这／￡的扩增??以黑曲霉总ＲＮＡ为模板，反转录合成ｃＤＮＡ，具体操作步骤按照试剂盒说明书??进行。合成的ｃＮＤＡ适当稀释后作为模板，按照２．２．５中方法，通过ＰＣＲ反应，对目??的基因戌／￡进行扩增。ＰＣＲ产物电泳结果如图３－３所示，大小约为０．８?ｋｂ，无其它杂??带，黑曲霉脂肪酶基因故／￡预期大小为８０１?ｂｐ，与电泳结果相吻合，可以进行载体构??建，并测序。??Ｍ?１??１?Ｋｂ——■鑛＿??０．７５?Ｋｂ——ｊ??图３－３目的基因／ｇ／Ｅ?ＰＣＲ电泳结果??Ｆｉｇ．?３－３?Ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｏｆ?ｔａｒｇｅｔ?ｇｅｎｅｓ?ｔｇｌＥ??Ｍ：?Ｍａｒｋｅｒ，?１：目的基因?
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本文编号：2853348