负载白藜芦醇纳米结构脂质载体防晒凝胶的制备及其防晒效果评价

发布时间：2020-10-25 01:52

　　 长期或大量的紫外线照射可导致皮肤细胞脂质过氧化,产生过量的活性氧(ROS),造成DNA损伤。局部补充抗氧化剂不仅可提高皮肤的抗氧化能力,并且能够减少紫外线诱导的氧化损伤。白藜芦醇(resveratrol,RES)为天然多酚类化合物,具有显著的抗氧化作用,用含RES的微乳液预处理豚鼠背部皮肤后几乎能完全防止中波紫外线(UVB)诱导皮肤红斑的形成,并且减轻紫外线诱导的氧化损伤。然而,RES在光、热条件下不稳定,活性减弱,使其在皮肤局部给药制剂的应用上受到限制。因此,构建合适的RES局部给药系统,提高RES的稳定性并使其在皮肤的表皮层有效蓄积是RES发挥抗氧化损伤、防护紫外线照射作用的关键。目的:本研究以乳木果酯为固体油脂、辛癸酸甘油酯为液体油脂,构成纳米结构脂质载体(NLC)。将活性成分RES负载于NLC并分散于凝胶基质中,构建纳米结构脂质载体凝胶(NLC-gel),以提高RES的稳定性,增强RES的抗紫外线效果。方法:1.将乳木果酯、复配乳化剂、维生素E(VE)、红没药醇于80℃加热至融化,加入4-甲基苄亚基樟脑(Parsol 5000)、丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷(Parsol1789)及甲氧基肉桂酸乙基己酯(Parsol MCX),搅拌均匀,待混合物温度降至40℃,加入RES/辛癸酸甘油酯混合溶液,制得油相;将尿囊素、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、去离子水于80℃加热并混合均匀,制得水相;60℃下混合水相和油相,采用超声乳化法制得载药纳米结构脂质载体(NLC)分散液。将载药NLC分散液加入羧甲基纤维素钠凝胶基质中,得纳米结构脂质载体防晒凝胶(NLC-gel)。2.用紫外分光光度计测定NLC-gel在280 nm、290 nm、300 nm、310 nm、320nm处的平均吸光度值。通过单因素实验考察辛葵酸甘油酯与乳木果酯投料比、白藜芦醇用量、乳化剂用量、剪切速度、剪切时间、超声功率及超声时间对NLC-gel吸光度值的影响。3.采用JMP7.0软件中的定制设计对NLC-gel的处方组成及制备工艺进行实验组别设计,按照生成的实验设计,制备NLC-gel,测定其吸光度值,并采用SPSS软件中的单变量线性模型进行数据分析,获得最优处方工艺。4.采用zeta电位及激光粒度测定仪、透射电镜等对NLC-gel的粒径、zeta电位及形态进行表征;采用黏度计及pH计测定NLC-gel的黏度和pH;采用UV 2000S型防晒系数体外测试分析仪测定NLC-gel的防晒系数(SPF)。5.建立同时测定RES、Parsol 5000、Parsol 1789、Parsol MCX含量的高效液相色谱(HPLC)方法,对NLC-gel的稳定性进行考察。6.建立HaCaT细胞长波紫外线(UVA)、UVB损伤模型,采用MTT法检测NLC-gel对UVA、UVB损伤HaCaT细胞的防护作用。7.采用多次刺激实验观察NLC-gel对家兔皮肤的刺激作用。8.采用激光共聚焦显微镜观察NLC-gel在皮肤组织的蓄积。9.建立小鼠背部皮肤UVB损伤模型,采用HE染色法观察NLC-gel对小鼠皮肤UVB损伤的防护作用,采用试剂盒检测NLC-gel对小鼠皮肤组织过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化酶(GPx)活性的影响。结果:1.单因素实验结果表明,RES用量、剪切时间和超声时间显著影响NLC-gel的吸光度值,并且RES用量与超声时间、剪切时间与超声时间之间存在交互作用。2.最优的处方组成及制备工艺为:辛癸酸甘油酯与乳木果酯投料比为1:5、RES用量为1%、乳化剂用量为4%、剪切速度为2000 r/min、剪切时间为5 min、超声功率为180 w、超声时间为10 min。3.NLC-gel的性状为乳白色胶状,均匀细腻,无分层现象,不干涸或液化,延展性良好,SPF值为43±5,粒径为(184±12)nm,zeta电位为-(33±2)mV,黏度为(16±1)Pa·s,pH为6.3±0.1。4.建立了同时测定NLC-gel中RES、Parsol 5000、Parsol 1789和Parsol MCX含量的HPLC方法,该方法稳定、准确。紫外老化试验结果表明NLC能明显提高RES、Parsol 5000、Parsol 1789和Parsol MCX的稳定性。NLC-gel中RES、Parsol5000、Parsol 1789和Parsol MCX的含量,以及NLC-gel粒径、黏度、pH在影响因素试验、加速试验及长期试验中均无明显变化。5.在UVA、UVB损伤HaCaT细胞模型上,NLC-gel与HaCaT细胞共孵育6h,能明显减少UVA和UVB对HaCaT细胞的损伤。6.NLC-gel对家兔皮肤无刺激性。7.激光共聚焦实验结果表明,NLC-gel转运药物主要蓄积于皮肤表皮层。8.用UVB照射小鼠背部裸露皮肤2 h,24 h后出现明显红斑,7天后皮肤厚度增加,表面结痂;HE染色结果表明,模型组皮肤结构紊乱,表皮增厚,表皮细胞大部分坏死,并有明显的炎细胞浸润;而NLC-gel预处理后的皮肤结构正常,表皮未见增厚,表皮细胞未见坏死,没有明显的炎细胞浸润。与正常对照组小鼠相比,模型组小鼠皮肤组织中的过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化酶(GPx)活性均显著下降;与模型组小鼠相比,NLC-gel预处理组小鼠皮肤中CAT、SOD和GPx的活性均显著升高。结论:制备的NLC-gel性质稳定、无刺激性,能有效提高RES的稳定性,增加RES在皮肤表皮层的蓄积,减少UVA和UVB对HaCaT细胞的损伤,有效防御UVB照射诱导的小鼠急性皮肤损伤,增强皮肤的抗氧化作用,具有显著的开发应用潜力。
【学位单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TQ658.24
【文章目录】：
缩略语表
中文摘要
Abstract
前言
文献回顾
实验一 负载白藜芦醇纳米结构脂质载体防晒凝胶的处方优化及表征
    1 材料
        1.1 仪器
        1.2 试剂
    2 实验方法
        2.1 NLC-gel的制备
        2.2 NLC-gel处方工艺优化
        2.3 NLC-gel的表征
        2.4 SPF值的测定
    3 结果
        3.1 NLC-gel处方工艺的单因素实验结果
        3.2 NLC-gel处方工艺交互作用的考察
        3.3 基于JMP7.0软件的定制设计优化处方
        3.4 数据分析
        3.5 验证实验
        3.6 NLC-gel的表征
        3.7 SPF值的测定
    4 讨论
实验二 NLC-gel的稳定性研究
    1 材料
        1.1 仪器
        1.2 试剂
    2 方法
        2.1 建立同时测定NLC-gel中RES、Parsol1789、Parsol5000和ParsolMCX含量的高效液相色谱方法
        2.2 方法学考察
        2.3 紫外老化试验
        2.4 稳定性试验
        2.5 统计学分析方法
    3 结果
        3.1 方法学考察结果
        3.2 紫外老化实验
        3.3 稳定性试验
    4 讨论
实验三 NLC-gel对HaCaT细胞的防护作用
    1 材料
        1.1 实验细胞
        1.2 主要实验药品及试剂
        1.3 仪器
    2 试验方法
        2.1 细胞培养
        2.2 NLC-gel的细胞毒性评价
        2.3 HaCaT细胞紫外线损伤模型的建立
        2.4 NLC-gel对HaCaT细胞的防护作用
        2.5 NLC-gel对HaCaT细胞的物理防护作用
    3 结果
        3.1 NLC-gel的细胞毒性作用
        3.2 HaCaT细胞紫外线损伤模型的建立
        3.3 NLC-gel对HaCaT细胞的防护作用
        3.4 NLC-gel对HaCaT细胞的物理防护作用
    4 讨论
实验四 NLC-gel对UVB诱导的急性皮肤损伤的防护作用
    1 材料
        1.1 仪器
        1.2 试剂
        1.3 动物
    2 方法
        2.1 皮肤刺激性试验
        2.2 NLC-gel在大鼠皮肤中转运药物的分布
        2.3 小鼠皮肤UVB损伤模型的建立
        2.4 NLC-gel对UVB诱导的急性皮肤损伤的防护作用
    3 结果
        3.1 多次皮肤刺激性试验
        3.2 NLC-gel转运药物在大鼠皮肤组织中的分布
        3.3 小鼠皮肤UVB损伤模型的建立
        3.4 NLC-gel对UVB诱导的急性皮肤损伤的防护作用
    4 讨论
小结
参考文献
个人简历和研究成果
致谢

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本文编号：2855286