甘露聚糖对纤维素酶水解的抑制及其缓解方法研究

发布时间：2020-10-27 04:51

　　 目前纤维素酶的成本过高是限制燃料乙醇工业化生产的主要因素之一,因而如何提高纤维素酶水解效率,降低纤维素酶用量是当前燃料乙醇生产领域的研究热点。在木质纤维原料中,半纤维素会覆盖在纤维素表面形成物理屏障,降低纤维素酶对纤维素的可及性。为克服该屏障作用,原料中的半纤维素需要转化为游离态或者是被水解为可溶性的糖。研究表明游离态的木聚糖(阔叶材和禾本科中半纤维素的主要成分)及其水解产物对纤维素水解有强烈的抑制作用,但是游离态的甘露聚糖(针叶材中半纤维素的主要成分)及其水解产物对纤维素水解效率的影响还尚不清楚。因而本文围绕游离态的甘露聚糖及其水解产物对纤维素酶水解纤维素的影响开展系统研究,探究了甘露聚糖及其水解产物抑制纤维素水解的机制,并在深入了解其抑制机制的基础上探究了缓解甘露聚糖及其水解产物抑制纤维素水解的有效措施,以期为开发水解得率高、酶制剂使用量少的高效酶水解技术提供理论依据。主要研究内容和结果如下:首先考察了不同种类的甘露聚糖(直链甘露聚糖、低分子量半乳甘露聚糖以及高分子量半乳甘露聚糖)对纤维素水解效率的影响,并探究了甘露聚糖结构特性包括分子量和半乳糖取代基等对甘露聚糖抑制纤维素水解的影响。研究结果显示,这三种甘露聚糖均会抑制纤维素水解,在纤维素酶水解微晶纤维素Avicel的体系中分别添加2.5mg/mL直链甘露聚糖、高分子量半乳甘露聚糖以及低分子量半乳甘露聚糖后,Avicel酶解得率降低了13.75%-39.10%。甘露聚糖对纤维素水解的抑制作用与甘露聚糖的结构特性密切相关,高分子量的甘露聚糖对纤维素水解的抑制作用强于低分子量甘露聚糖的抑制作用,而半乳糖基支链的存在会使甘露聚糖对纤维素水解的抑制作用能力减弱。探究了甘露聚糖对单一纤维素酶组分(内切葡聚糖酶Cel5A、外切葡聚糖酶Cel6A和Cel7A以及β-葡萄糖苷酶Cel3A)酶促反应动力学的影响,揭示了甘露聚糖抑制纤维素水解的机制。通过探究甘露聚糖对单一纤维素酶组分水解能力的影响,发现甘露聚糖对Cel5A、Cel6A和Cel7A的水解能力有强烈的抑制作用,但是对Cel3A的水解能力没有影响。动力学试验结果表明甘露聚糖会占据Cel7A的活性位点,从而竞争性的抑制Cel7A的活力,其中高分子量半乳甘露聚糖对Cel7A活力的抑制作用最强(抑制常数K_i为0.43 mg/mL),低分子量半乳甘露聚糖的抑制作用次之(抑制常数K_i为0.47mg/mL),直链甘露聚糖的抑制作用最弱(抑制常数K_i为0.50 mg/mL)。研究了甘露聚糖水解产物(甘露低聚糖、甘露糖和半乳糖)对纤维素水解效率的影响。研究结果显示,甘露低聚糖、甘露糖和半乳糖也会抑制纤维素水解效率,其中甘露低聚糖抑制纤维素水解的能力最强,其次是半乳糖,再次是甘露糖。在纤维素酶水解Avicel的体系中分别添加等量的(5 mg/mL)甘露低聚糖、半乳糖和甘露糖后,Avicel酶解得率分别降低了12.70%、4.23%和3.97%。进一步探究甘露低聚糖结构特性包括链长和半乳糖取代基等对甘露低聚糖抑制纤维素水解的影响可知,甘露低聚糖对纤维素水解的抑制作用随甘露低聚糖链长的增加而减弱,随半乳糖取代基的移除而增强。通过探究甘露低聚糖、甘露糖及半乳糖对单一纤维素酶组分水解能力的影响,发现甘露低聚糖对Cel5A和Cel3A的水解能力没有抑制作用,但是会抑制Cel6A和Cel7A的水解能力,而甘露糖和半乳糖对Cel5A、Cel6A和Cel7A的水解能力均有抑制作用。动力学试验结果进一步表明甘露低聚糖是Cel7A的竞争性抑制剂(抑制常数K_i为1.57mg/mL)。探究了甘露聚糖酶对甘露聚糖抑制纤维素水解的缓解作用,并从缓解甘露聚糖抑制的角度揭示了甘露聚糖酶强化木质纤维原料酶解的机制。研究结果显示,甘露聚糖酶能有效的缓解甘露聚糖及其水解产物对纤维素水解的抑制作用,在纤维素酶水解Avicel的体系中添加5 mg/mL半乳甘露聚糖后,Avicel的酶解得率从38.75%降低到了18.68%,进一步添加内切甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶和半乳糖苷酶后,Avicel的酶解得率显著提高到了35.33%。在纤维素酶水解白云杉纤维素的过程中,添加甘露聚糖酶后,白云杉纤维素的酶解得率提高了14.29%。进一步分析酶解液中纤维素酶活力的变化可知,添加甘露聚糖酶后,酶解液中Cel5A和Cel7A的活力分别提高了14.30%和10.91%,表明甘露聚糖酶可通过缓解酶解液中甘露聚糖对Cel5A和Cel7A活力的抑制作用,提高纤维素酶的活力,进而强化白云杉纤维素酶解。探究了化学助剂Tween 80对甘露聚糖及其水解产物抑制纤维素水解的缓解作用。研究结果显示,Tween 80能在一定程度上缓解甘露聚糖、甘露低聚糖、甘露糖及半乳糖对纤维素水解的抑制作用,在纤维素酶水解Avicel的体系中分别添加半乳甘露聚糖(5 mg/mL)、甘露低聚糖(5 mg/mL)、甘露糖(10 mg/mL)和半乳糖(10 mg/mL)后,Avicel的酶解得率从48.60%分别降低到了26.64%、39.96%、39.15%和36.90%,进一步添加Tween 80后,Avicel的酶解得率分别提高到了36.00%、46.58%、46.35%和45.00%。动力学试验结果表明Tween 80对Cel5A和Cel3A的活力没有影响,但是对Cel7A的活力有激活作用,该激活作用可以有效的缓解甘露聚糖及其水解产物对Cel7A活力的抑制作用,从而提高酶水解过程中纤维素酶的活力,进而提高木质纤维原料的酶解效率。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TQ353
【部分图文】：

为增加纤维素酶对纤维素底物的可及度，提高木质纤维原料糖转化效率，在对原料进行酶解之前需要用化学、物理或者生物等方法对其预处理 (Putro et al. and Huang 2014)。尽管预处理过程成本较高（平均成本为 20 美元/吨生物质），理在提高木质纤维原料后续酶水解效率、减少纤维素酶所需剂量从而降低纤成本中有极为重要的作用(Mosier et al. 2005b)。预处理提高木质纤维原料水解用主要归结于以下几个方面：（1）移除半纤维素；（2）移除和再分配木质素；（纤维素的聚合度和结晶度；（4）增加原料的孔隙度 (Chandra et al. 2007; Mansfi1999; Pan et al. 2005)。图 1-1 为预处理对木质纤维原料结构影响的示意图。经发展，目前针对不同的原料已开发出了一系列不同的预处理方法，目前常见方法大致可分为物理法（例如球磨、碾磨、辐射）、化学法（例如碱、稀酸、有机溶剂等）、物理化学法（例如蒸汽预处理、水解预处理）和生物法，以及的结合 (Alvira et al. 2010; Sun et al. 2016)。不同预处理方法的优缺点如表1-3所可知，常用的预处理方法均有其独特的一面，同时均存在一定的缺陷，因而有可以适用于所有底物的，高效的预处理技术。故在选择预处理技术时要充物组分和类型 (Mussatto and Dragone 2016)。

1.3.2.1 纤维素酶系统纤维素酶是水解木质纤维原料的主要酶系。纤维素酶系统是由内切葡聚糖酶（EC3.2.1.4）、外切葡聚糖酶（EC 3.2.1.91）和 β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）组成 (Taha et al.2016; Watanabe et al. 2010)。如图 1-2 所示，内切葡聚糖酶随机切割无定形区纤维素主链的 β-1，4 糖苷键，生成不同聚合度的、带有非还原性末端或者还原性末端的寡糖，外切葡聚糖酶 Cel7A 作用于纤维素的还原性末端，Cel6A 作用于纤维素的非还原性末端将其水解为纤维二糖，然后 β-葡萄糖苷酶将纤维二糖进一步水解为葡萄糖 (Benoitet al. 2015; van den Brink and de Vries 2011)。单一组分的纤维素酶不能有效的水解纤维素，纤维素的高效水解需要这三种组分的协同作用 (Henrissat et al. 1985; Nidetzky et al.1994; Zhang and Lynd 2004)。在常见的里氏木霉属纤维素酶系统中，外切葡聚糖酶Cel7A 的比重高达 60%左右，外切葡聚糖酶 Cel6A 的比重约为 15%，内切葡聚糖酶的比重相对较低，约 10%左右 (McFarland et al. 2007b)。

第一章 文献综述1.3.2.2 半纤维素酶系统和纤维素相比，半纤维素的结构更加复杂，因而水解半纤维素所需要的酶系也更加复杂。水解木聚糖所需的酶包括内切 β-1,4-内切木聚糖酶（EC 3.2.1.8）、α-L-阿拉伯糖苷酶（EC 3.2.1.55）、乙酰基木聚糖酯酶（EC 3.1.1.72）、α-D-葡糖醛酸酶（EC 3.2.1.139）、阿魏酸酯酶（EC 3.1.1.73）以及 β-木糖苷酶（EC 3.2.1.37）等 (Taha et al. 2016)。如图 1-3 所示，内切木聚糖酶切割木聚糖主链为寡糖，然后由 β-木糖苷酶将其水解为木糖。α-L-阿拉伯糖苷酶和 α-D-葡糖醛酸酶移除相应的阿拉伯糖取代基和 4-O-甲基葡萄糖醛酸取代基 (Iveti et al. 2017; Kumar and Murthy 2013; Saha 2003; Van Dyk andPletschke 2012)。乙酰酯酶作用于乙酰取代基，阿魏酸酯酶则水解阿拉伯糖取代基和阿魏酸之间的酯键，从而使得木聚糖和木质素分离 (Mosier et al. 2005b)。
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本文编号：2858068