硫化叶菌病毒基因ORF2促进红冬孢酵母产多不饱和脂肪酸和类胡萝卜素的研究

发布时间：2020-10-27 05:22

　　 多不饱和脂肪酸和类胡萝卜素因其在食品和医药领域的广泛作用而得到人们极大的关注,当前利用微生物发酵生产多不饱和脂肪酸和类胡萝卜素具有诸多优点,由于酵母生产迅速且生物量较高,利用酵母生产多不饱和脂肪酸和类胡萝卜素已成为人们关注的热点,以代谢工程方法改造酵母生产多不饱和脂肪酸和类胡萝卜素也具有良好前景。我们前期研究表明,病毒STSV2编码的ORF2蛋白在感染宿主过程中能显著上调病毒和宿主基因的转录水平,可能是一个潜在的转录激活因子。此外,产油酵母—红冬孢酵母(Rhodosporidium kratochvilovae)YM25235菌株同时产多不饱和脂肪酸和类胡萝卜素,因此本研究拟将ORF2基因转化YM25235菌株中进行表达,分析其对YM25235菌株生长以及多不饱和脂肪酸和类胡萝卜素合成的影响。将ORF2基因插入表达载体pRH2304,构建重组表达质粒pRH2034ORF2,利用农杆菌介导的转化法将其转化至红冬孢酵母YM25235中,然后分析ORF2基因表达对YM25235菌株环境胁迫抗性的影响。结果显示,ORF2基因表达提高了YM25235菌株的高盐胁迫,高渗透压胁迫和低温胁迫的耐受性,同时也能促进转基因菌株中甘油合成量。进一步脂肪酸分析结果表明,ORF2转基因菌株中亚油酸(linoleic acid,LA)和亚麻酸(linoleinic acid,ALA)含量较野生型菌株从16.97%和3.42%增加到22.39%和5.88%,分别增加了1.32倍和1.72倍,而油酸(oleic acid,OA)的含量明显减少。mRNA转录水平结果还显示,ORF2基因表达促进了催化转基因菌株中催化OA连续转化为LA和ALA的Δ~(12/15)-脂肪酸脱氢酶基因RKD12的mRNA转录水平提高了1.89倍。进一步的凝胶阻滞技术(EMSA)分析发现,通过大肠杆菌BL21异源表达的ORF2蛋白可以与RKD12基因的启动子RKD12P之间存在相互作用。这些结果表明在YM25235转基因菌株中ORF2基因编码产物结合RKD12基因的启动子RKD12P,促进RKD12基因的mRNA转录水平,从而增加了PUFAs的合成量,进而提高了菌株的低温适应性。为了研究ORF2基因表达对红冬孢酵母YM25235菌株油脂和类胡萝卜素合成的影响,进一步对ORF2转化的YM25235菌株中油脂和类胡萝卜素含量变化进行分析。结果显示,与对照菌株相比,ORF2基因转化的YM25235转基因菌株中油脂含量为31.06 mg/g,较野生型菌株的20.3 mg/g提高了1.53倍,而且转基因菌株中类胡萝卜素含量为2.29 mg/g,较野生型菌株的类胡萝卜素含量1.33mg/g提高了约1.72倍。mRNA转录水平分析结果也表明,ORF2基因表达能促进了油脂和类胡萝卜素合成相关基因的转录,从而提高了转基因菌株中油脂和类胡萝卜素的合成。这些结果进一步证表明,ORF2蛋白是一个普遍性的能促基因转录的转录调节因子。综上所述,硫化叶菌病毒STSV2基因ORF2表达促进了红冬孢酵母YM25235菌株抗高盐和高渗透压胁迫以及低温生长适应性,还显著提高了YM25235菌株中多不饱和脂肪酸、油脂和类胡萝卜素的合成。本研究结果为红冬孢酵母多不饱和脂肪酸、油脂和类胡萝卜素的代谢工程化生产提供了理论依据,同时也为进一步分析ORF2蛋白的结构和功能提供参考。
【学位单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TQ920.1
【部分图文】：

和延长酶途径，只是其所含的去饱和酶或者延长酶种类和数量不同导致最终合成的脂肪酸成分的差异。在酵母菌中，脂肪酸从头合成始于线粒体中形成柠檬酸，图1.1 ω-3和ω-6脂肪酸去饱和链伸长的途径Figure1.1 Pathways for desaturation chain elongation of omega-3 and omega-6fatty acids

柠檬酸裂解产生的乙酰-CoA 通过脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）生成饱和脂肪酸，再通过连续延长和去饱和反应生成多不饱和脂肪酸。图1.2[9]总结了酵母中以葡萄糖为底物，酵母体内不饱和脂肪酸合成途径以及通过代谢工程手段在酵母体内实现的PUFAS 生产，如花生四烯酸、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）合成的路径，其中所涉及的一系列脱氢酶、去饱和酶和延长酶已经从众多微生物中分离出来，这为对酵母菌进行代谢工程改造生产PUFAs 提供了可能[10]。1.3 多不饱和脂肪酸的生物学功能1.3.1 对机体免疫功能的影响PUFAs的免疫调节功能已经在人类医学和动物试验中得到证明。饲粮中添加图 1.2 酵母中脂肪酸合成途径Figure 1.2 Fatty acid synthesis pathway in yeast

昆明理工大学硕士学位论文厚度，流动性或渗透性），这对于它们的正常运作起关键作用。例如，稳定性和一些其他膜相关过程，如信号转导被改变[58-60]。随后的变化也可能导致膜对 ROS的抗性的显著增强，对人类健康具有积极影响，因为许多慢性疾病的分子机制似乎至少部分涉及 ROS 相互作用。
【参考文献】

相关期刊论文 前10条

1 张琦;李凌彦;赵汝丽;魏云林;林连兵;季秀玲;;促进微生物生产多不饱和脂肪酸的研究[J];食品与生物技术学报;2015年08期

2 王莉梅;刘睿杰;金青哲;张榴萍;李碧霞;王兴国;;多不饱和脂肪酸在癌症发生中的作用机制研究进展[J];中国油脂;2014年08期

3 曲湘勇;蔡超;贺长青;何俊;魏艳红;杨清丽;徐勋;;溆浦鹅肉营养成分与品质分析[J];经济动物学报;2014年03期

4 贾彬;王亚南;何蔚红;刘德海;谢复红;王继雯;冯菲;黄瑛;;生物柴油新原料——微生物油脂[J];生物技术通报;2014年01期

5 何静辉;杨静;王丽;李日辉;穆春;贾晓琳;王林嵩;;转萝卜过氧化物酶基因Rsprx1提高毕赤酵母抗盐性[J];中国生物化学与分子生物学报;2011年12期

6 来伟旗;张岭;刘臻;陈建国;梅松;傅颖;刘冬英;胡乐升;王茵;;多不饱和脂肪酸小鼠抗氧化功能的实验研究[J];职业与健康;2011年24期

7 来伟旗;张岭;刘臻;刘冬英;陈建国;梅松;傅颖;胡乐升;王茵;;多不饱和脂肪酸抗氧化功能的人体试验[J];职业与健康;2011年23期

8 李荣刚;麻名文;王春阳;王雪鹏;李福昌;;日粮添加亚油酸对断奶至2月龄肉兔生长性能、免疫指标及脂质代谢的影响[J];中国兽医学报;2011年11期

9 张晓阳;杜风光;池小琴;王品美;郑道琼;吴雪昌;;代谢工程与全基因组重组构建酿酒酵母抗逆高产乙醇菌株[J];中国生物工程杂志;2011年07期

10 黄宝玺;王大为;王金凤;;多不饱和脂肪酸的研究进展[J];农业工程技术(农产品加工业);2009年08期

本文编号：2858104