酶法提取虎杖中白藜芦醇及白藜芦醇酯的合成研究

发布时间：2020-10-31 00:29

　　 白藜芦醇是一种天然多酚,具有显著的抗氧化活性,在预防癌症、保护心血管和神经系统、提高免疫、延长寿命等方面有重要作用,目前其在食品、医药、膳食补充剂、保健品和化妆品领域中有重要的应用价值。由于白藜芦醇生物利用度非常低,且在体内的代谢和排泄能力较强,把白藜芦醇和羧酸酯化,可有助于增加白藜芦醇的亲脂性、细胞穿透性和生物利用度,且两者之间还具有协同效应。本研究筛选一株能高产β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,BGL,EC 3.2.1.21)的菌株,利用该酶高效水解虎杖苷得到白藜芦醇,以白藜芦醇和有机酸为原料合成多种白藜芦醇酯。通过对实验室保藏的14株具有产β-葡萄糖苷酶潜力的不同真菌(其中有4株未鉴定)的产酶能力分析,确定产酶能力最高的菌株Aspergillus niger SK34.002,其所产胞外BGL酶活力可达6.68 U/mL。其ITS序列全长561 bp,已提交至NCBI GenBank数据库,获得数据库登记号为MH032751。BGL的合成比菌体生长滞后,第3天开始产酶,最大产酶期在8天左右,将所产酶液作用于虎杖粉,对虎杖苷水解效果显著,且该菌具有很好的遗传稳定性。收集A.niger SK34.002的发酵液作为粗酶液,经活性炭脱色、硫酸铵分级沉淀、HiTrap Q HP离子交换层析和Superdex 200 10/300 GL凝胶过滤层析等步骤,获得纯化的BGL,比酶活为76.4 U/mg,纯化倍数达45倍。对酶的纯度和分子量进行测定,结果表明BGL是单亚基酶,分子量为128 kDa。通过对BGL的酶学性质研究发现,该酶的最适反应pH为4.5,pH超过7.0以后基本丧失酶活;在pH 3.0~4.5的柠檬酸缓冲液中保持24 h后,酶活仍可保持90%以上。该酶在60~70℃之间表现出较高的酶活力,其最适反应温度为70℃,但在该温度下不稳定;55℃以下保持高度的稳定性,该酶储藏稳定性非常好,在工业化生产中有明显优势。常见金属离子及EDTA对酶活基本没有影响,说明BGL为非金属依赖性酶。对该酶的底物特异性研究发现,该酶对所选的11种底物都能发生水解,其中活性最好的前三个底物分别是纤维二糖(209.9 U/mgprotein)、4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG,173.1U/mgprotein)和虎杖苷(75.9 U/mgprotein)。该酶对以上三个底物发生水解反应的米氏常数K_m分别为8.9 mM、2.9 mM和0.74 mM,可见,BGL对虎杖苷具有相对较低的K_m值,说明该酶对虎杖苷有更好的亲和力。同时研究了葡萄糖对BGL的抑制性,结果显示葡萄糖对BGL在pNPG为底物时表现为竞争性抑制,抑制常数K_i为3.8 mM。纯酶经SDS-PAGE蛋白电泳分析,切胶处理后采用MALDI-TOF/TOF-MS分析肽谱和各肽段的氨基酸信息,经检索获得一个Mascot Score达到173的有效匹配,匹配蛋白为beta-glucosidase[Aspergillus niger],氨基酸覆盖率5%,判断BGL为β-葡萄糖苷酶,但从有效的匹配肽段仅有两段推测该蛋白是一种新蛋白。以该酶对虎杖粉中的虎杖苷进行酶解,通过单因素实验得出酶解的最优工艺条件为:β-葡萄糖苷酶用量2.7 U/(g虎杖),pH=4.5,60℃酶解2.5 h,在该条件下,虎杖苷的转化率达到98%以上,白藜芦醇的含量比未酶解前提高了6.2倍。以21%(w/w)乙醇/22%(w/w)硫酸铵双水相体系为萃取剂,利用超声辅助双水相萃取技术直接从虎杖酶解液中提取白藜芦醇。利用聚酰胺柱层析进行分离纯化,干燥后得纯度为80.8%的白藜芦醇,总收率73.6%。以白藜芦醇和有机酸为起始原料,经两步法合成了6个白藜芦醇酯:三乙酰水杨酸白藜芦醇酯、三肉桂酸白藜芦醇酯、亚麻酸-3-白藜芦醇酯、亚麻酸-4'-白藜芦醇酯、三花生四烯酸白藜芦醇酯和三DHA白藜芦醇酯。所合成的化合物通过质谱、红外、氢谱、碳谱等检测手段确认结构。
【学位单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TQ28
【部分图文】：

图 1-4 β-葡萄糖苷酶双取代“两步法”构型保持机理[99]Fig.1-4 A two step double-displacement retaining mechanism for β-glucosidase

图 1-5 研究思路图Fig. 1-5 The flow chart of experimental methods具体研究内容如下：1. β-葡萄糖苷酶产生菌株的筛选和鉴定。筛选获得 β-葡萄糖苷酶高产菌株，菌株进行鉴定；

图 2-1 pNP 标准曲线Fig.2-1 Standard curve of pNP定工作液的配制：准确称取 150.6 mg pNPG，溶解于 100 )中，得 5 mM pNPG 底物工作液，备用。
【参考文献】

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6 潘利华;罗建平;;β-葡萄糖苷酶的研究及应用进展[J];食品科学;2006年12期

7 李梦青;耿艳辉;刘桂敏;张晴;康彦芳;;双水相萃取技术在白藜芦醇提纯工艺中的应用[J];天然产物研究与开发;2006年04期

8 李远华;β-葡萄糖苷酶的研究进展(综述)[J];安徽农业大学学报;2002年04期

本文编号：2863212