米根霉脂肪酶的稳定性及稳定剂研究

发布时间：2020-10-31 12:53

　　 脂肪酶是一类重要的工业水解酶,已被广泛应用于食品工业、生物柴油、洗涤工业、生物制药等领域。米根霉脂肪酶(Rhizopus oryzae lipase,ROL)是一种典型的脂肪酶,目前已商业化,常被用于高效制备结构脂质、生物柴油以及手性化合物。但和大多数酶一样,ROL表现出热不稳定性。为提高ROL的热稳定性,拓宽其应用范围,本文利用发酵的粗酶液来研究ROL的热失活规律和酶的稳定剂,主要研究内容及结果摘要如下:1.将粗酶液ROL置于30-80℃的水浴中孵育以热失活。结果表明,在30-50℃环境下处理3小时,保持相对酶活力95%以上,基本不失活;当温度升高至60℃,处理3小时,相对酶活力仅剩约29.50%,酶已有较大程度的失活;而当温度升至70℃和80℃后,水浴3分钟,残余相对酶活力分别为21.76%和9.26%,说明绝大部分酶失活。对较高温度下热失活规律进一步探究发现,上清中的相对酶活力和相对蛋白含量具有一致性,且ROL的热失活过程符合两步失活模型,即在活性态和非活性态之间还存在一个部分失活态。2.对实验室发酵的ROL进行一系列分离纯化,得到纯度较高的ROL,纯化倍数为1.62,回收率为10.83%。将纯化后的ROL和未纯化的ROL在不同温度下进行处理,发现未纯化的ROL的稳定性表现较好。采用圆二色谱法、内源荧光光谱法以及外源荧光光谱法检测纯化ROL的结构变化,发现,随着温度的升高,表征其二级结构的负槽消失,说明酶分子的二级结构受到破坏;且内源荧光光强增加,表明包埋在酶分子内部的芳香族氨基酸残基随着结构的打开而逐渐暴露在外;外源荧光光强增加,亦说明疏水性基团也逐渐暴露出来。所有结果均说明,在ROL失活过程中随着温度的上升,二级结构和三级结构都会被逐渐破坏,导致酶逐渐失活。3.通过对各因素的筛选以及单因素优化实验,确定葡萄糖、山梨醇、NaCl、MgCl_2、聚氧乙烯吡咯烷酮-30(PVP-30)作为ROL热稳定剂复配原料。通过PB实验确定显著因子为葡萄糖、山梨醇、NaCl,再通过爬坡试验逼近最佳浓度,最后通过响应面实验得出最佳复配比例为:葡萄糖浓度35.94%(m/v)、山梨醇浓度34.82%(m/v)、NaCl浓度2.50 mol/L,此条件下相对酶活力预测值为97.715%,与实际值高度拟合。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TQ426.97
【部分图文】：

华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 分析离纯化结果 可知，当饱和度低于 50%时，沉淀法的效果并不明显，沉和度达到 60%时，ROL 沉淀开始较多析出，当饱和度达 1/2）时沉淀法效果最好，能较多析出目标蛋白，但是杂。由于更高饱和度的硫酸铵可能会导致蛋白质的失活，择 80%饱和度的硫酸铵进行盐析。

图 3.2 ROL 等电点和分子量的在线计算Fig.3.2 Online calculation of ROL isoelectric point and molecular weight纯化的各项参数如表 3.2 所示，由结果可知，在对 ROL 进行分离白和总酶活力是逐渐减小的，这说明在分离纯化的过程中 ROL 是硫酸铵沉淀，酶活回收率为 59.82%，说明溶液中的蛋白质较多的为 1.14，说明 ROL 纯度并没有有效的提升。透析后回收率和纯化相差不大。离子交换层析后，纯化倍数为 1.61。而疏水层析法的，较离子交换层析法而言并没有多大的提高。对 ROL 粗酶液进行后操作后，最终回收率只有 10.83%，纯化倍数为 1.62。相较于常数而言，本次实验的纯化倍数较低，这是因为 ROL 在毕赤酵母中高，其他杂蛋白含量较少，通过蛋白胶我们也可以看到经过纯化明显的提升，杂蛋白很少。

ROL 的分离与纯化。A：硫酸铵沉淀法。M：蛋白 marker;1：粗酶液；2：酶液；B：离子交换层析法。M：蛋白 marker;1：粗酶液；2：离子交换层：疏水层析法。M：蛋白 marker;1：粗酶液；2：疏水层析法纯化后的酶.3.3 Isolation and purification of ROL.A：Ammonium sulfate precipitation；ane1:Crude enzyme solution；Lane2：Enzyme solution purified by ammoni；B：Ion exchange chromatography；M:maker；Lane1:Crude enzyme solulution purified by ammonium sulfate precipitation；C：Hydrophobic chrom；Lane1:Crude enzyme solution；Lane2：Enzymatic solution purified by hychromatography.温度下 ROL 活性变化结果 在不同温度下处理 1 h 后酶活力的变化结果如图 3.4。由结果可化的 ROL 在低温条件下较为稳定，30℃和 40℃下水浴 1 h，
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本文编号：2863972