酿酒酵母产D-乳酸的代谢工程研究

发布时间：2020-11-01 08:12

　　 D-乳酸(D-LA)作为L-乳酸的同分异构体,是一种具有高附加值的平台化合物。它可作为手性药物、农药、及其他大宗化学品的中间体,也是可降解塑料聚乳酸(PLA)的合成单体。微生物法生产D-LA可以避免化学法带来的环境污染。酿酒酵母作为一种安全性高的单细胞低等真核生物,具有耐酸性强、易于进行基因编辑等优点,很适合于生产D-LA。但是,外源基因在酿酒酵母中存在表达差异性,重组菌株生长变慢,酸性物质的积累对细胞毒害等问题,严重制约了D-LA在酿酒酵母中的生产。本文用代谢工程的方法从D-乳酸脱氢酶(D-LDH)的表达优化,耐酸性的增强,菌株生长速率的提高等方面构建D-LA高产菌株。首先,以敲除丙酮酸脱羧酶基因的TAMH菌株为宿主菌,组合表达优化筛选D-LA生产菌株。针对4个启动子,5个D-LDH,以及2个终止子的组合表达研究表明,在构建的40个菌株中,含PTEF1-E.coli D-LDH-Tsynth25 表达载体的菌株TCSt,D-LA产量最高,达到5.8 g/L,光学纯度达到了99.9%。为了提高D-LA的产量,将该基因表达簇插入到敲除Pdcl和Pdc6基因的YIP-01菌株的Ty1多拷贝位点,利用双酶偶联方法筛选高产D-LA的整合菌株。基因组重测序结果表明,得到的整合菌株YIP-pTCSt-301含有3个D-LDH拷贝。在分批补料条件下发酵,该菌株产生了35 g/L D-LA,得率为0.45 g/g,产率为0.9 g/L/h。为了进一步提高D-LA产量和得率,敲除了消耗D-LA的相关基因Dldl和Cyb2,转运D-LA到胞内的相关基因Jen1,以及产乙醇的相关基因Adh1。得到的YIP-JCDA1菌株在分批补料条件下发酵,产生了80 g/L D-LA,得率提高到0.6 g/g,产率为1.1 g/L/h。其次,在YIP-JCDA1菌株的基础上表达了Issatchenkia orientalis的IoGasl基因,其编码蛋白具有耐受低pH和高盐特性。得到的YIP-IJCDA1菌株在分批补料条件下发酵,D-LA达到了85.3 g/L,得率提高到0.71 g/g,产率提高到1.20 g/L/h。在此基础上,继续敲除甘油合成途径的Gpd1和Gpd2基因和乙醇合成途径的相关基因Adh5。得到的YIP-A15G12菌株,其D-LA产量达到92.0 g/L,得率为0.70 g/g,产率为1.21 g/L/h。D-LA光学纯度为99.7%。再次,在YIP-IJCDA1菌株中过表达耐乙酸的Acs2基因和Haal基因,以及消耗胞质内乙醛的Ald6基因,得到的菌株的D-LA产量却没有显著提高。在含IoGasl基因的YIP-IJCDA1菌株中过表达耐受乙酸的Whi2基因,菌株的葡萄糖发酵能力显著增强。这表明Whi2基因能与IoGasl基因共同作用增强菌株在高浓度乙酸压力下的葡萄糖发酵能力。最后,为了增加胞质乙酰辅酶A的水平,在YIP-A15G12菌株中,表达了大肠杆菌的乙酰化乙醛脱氢酶(A-ALD)基因。A-ALD基因(mhpF和eutE)的表达提高了酿酒酵母胞内的乙酰辅酶A水平,提高了菌株的生长速率。含有mhpF基因的YIP-m-ald6菌株,产D-LA的能力显著提高。分批补料发酵55h,产率从1.21 g/L/h增加到1.68 g/L/h,D-LA产量达到了92.6 g/L,得率为0.70 g/g。D-LA光学纯度达到了99.8%。
【学位单位】：中国科学院大学(中国科学院过程工程研究所)
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TQ921.3
【部分图文】：

?第１章引言???第１章引言??１．１?Ｄ－乳酸的生产方法??１．１．１?Ｄ－乳酸的性质??乳酸分子式为Ｃ３Ｈ（，０３，又名２－羟基丙酸，ｅｘ－羟基丙酸，或者丙醇酸，分子??量为９０，熔点为１８．７?°Ｃ，在２５°Ｃ时密度为１．０５７?ｇ／ｍＬ。乳酸有一个手性中心，??有Ｄ－（－）乳酸（Ｄ－ＬＡ）和Ｌ－（＋）乳酸（Ｌ－ＬＡ）两个对映异构体，其结构式如图１．１。??乳酸溶于水、乙醇，有刺激性。乳酸的解离常数（ｐＫａ）在３．７９－３．８６之间［１］。??

?＂?—？??一－、ｗ??＾＇?ＴＡＴＡ?；＼ＡＴＧ??图１．５启动子结构示意图１４２１??Ｆｉｇｕｒｅ?１．５?Ｔｈｅ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｐｒｏｍｏｔｅｒ１４２１．??启动子在基因表达的转录调控环节起着非常重要的作用，启动子的调控效率??会直接影响基因的表达效率。启动子是位于结构基因５＇端上游的一段非编码??ＤＮＡ序列。它通过活化ＲＮＡ聚合酶，使之与模板ＤＮＡ准确结合，启动转录功??能。真核生物的启动子主要由转录因子结合位点（ＴＦＢＳ），和非翻译区（ＵＴＲ）??组成。转录因子结合位点的ＤＮＡ序列较短，它对启动子调节功能有至关重要的??作用，这段ＤＮＡ序列称为核心区。非翻译区序列的长短也会影响转录的效果，??１２??

距离达到１０?ｂｐ就可以保障终止子的功能行使。效率元件的作用是增强下游位置??元件的效率，Ｔ富集区的作用是调控ｍＲＮＡ的稳定性和ｍＲＮＡ的半衰期［４９］。这??种终止子的结构示意图如图１．６所示。??３?—〇严??Ｔ，，，詹???５?－?ＴＡＧ?ＴＡＴＡＴＡ?ＡＡＷＡＡＡ?Ｔｒｋｈ?Ｙ（Ａ）？?Ｔｒｉｃｈ?－?３，??ＥＨＩｃｉｅｎｃｙ?Ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ?Ｐｏｌｙ?Ａ）??ｂ?令，?Ｔ＿〇ｒ??５—?ＴＡＧ?ＴＡＴＡＴＡ?ＡＣＴＧＴＣＴＡＧＡ?ＡＡＴＡＡＡ?ＧＡＧＴＡＴＣＡＴＣ?ＴＴＴＣＡＡＡ?－?－ｖ??Ｃ??Ｔｅｍｙｎａｔｏｒ?＾??５－ｉ?ＴＡＧ?｜｜?＊?（ＴＡ）ｎ?＊?ＡＡＷＡＡＡ?＊?Ｙ（Ａ）ｎ?＊?＿?ｒ??Ｕｐｓｔｒｅａｍ?Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ?Ｌｉｎｋｌ?Ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ?Ｌｉｎｋ２?Ｐｏｌｙ（Ａ）?Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ??图１．６终止子结构示意图１４９１??Ｆｉｇｕｒｅ?１．６?Ｔｈｅ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ１４９１，?（ａ）?Ｇｅｎｅｒａｌ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ａ?ｙｅａｓｔ?ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ，?（ｂ）??Ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ?ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ?ｂｙ?ａｄｄｉｎｇ?Ｌｉｎｋ?ｅｌｅｍｅｎｔｓ，?（ｃ）?Ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ??ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ?ｂｙ?ａｄｄｉｎｇ?Ｌｉｎｋ?１，?Ｌｉｎｋ２，?Ｕｐｓｔｒｅａｍ，?ａｎｄ?Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ?ｅｌｅｍｅｎｔｓ．??常见的酵母天然终止子有Ｔｃｔｃ／
【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 陈国强;王颖;;中国“生物基材料”研究和产业化进展[J];生物工程学报;2015年06期

2 甄光明;;乳酸及聚乳酸的工业发展及市场前景[J];生物产业技术;2015年01期

本文编号：2865261