纤维素酶的热保护及其固定化技术研究

发布时间：2020-11-01 10:05

　　 作为广泛应用的酶之一,由内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶组成的复合纤维素酶在食品、造纸、纺织、动物饲料等诸多行业起着重要作用。然而,游离的纤维素酶易受外界环境作用导致酶活性损失,以及难于回收等特点造成了酶的使用成本过高,限制了其大规模的工业化应用。通过酶活性保护作用可以解决目前所面临的这些应用难题。纤维素是地球上含量最为丰富的可再生资源之一,却没有得到有效利用,甚至其废弃物对环境造成了一定的破坏。利用纤维素酶降解纤维素得到葡萄糖,再进一步发酵可制得生物燃料乙醇,能够有效地缓解人类目前面临的能源危机。实验以大分子聚乙二醇单甲醚为基础,合成亲水性的大分子单体PEG-MA,再进一步与单体甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)合成聚合度为46的共聚物PEG-g-PDMAEMA。在中性条件下,加入4 mg/mL的带正电荷的共聚物与0.5mg/mL的活性区域带负电荷氨基酸的纤维素酶通过静电作用相结合,共聚物覆盖在酶的活性区域,从而屏蔽外界环境等不利因素。常温条件下加入20 mg/mL带负电荷的聚丙烯酸,与PEG-g-PDMAEMA形成更强有力的静电作用,纤维素酶得以解吸,从而酶活性几乎全部恢复。此两步法人工分子伴侣PEG-g-PDMAEMA/PAAc体系的构建在对酶活力的“开/关”调控基础上对纤维素酶具有热保护作用。将PEG-g-PDMAEMA/纤维素酶复合物在90℃下保持20min,仍有58%的相对酶活力得以恢复。通过两种单体甲基丙烯酰胺(MAA)和丙烯酸(AAc)合成可溶-不溶性UCST型共聚物PMAAc。50℃下,40μg/mL的戊二醛活化载体氨基5 h,随后共价作用“柔性”固定化纤维素酶,其UCST为19℃。对固定化条件进行了优化,35℃下,4 mg/mL的纤维素酶在pH=5.0缓冲溶液中固定化4 h,酶的固载量达到46.6mg/g的最佳值。固定化后的纤维素酶拓宽了pH和温度作用范围,且稳定性有了显著提高。由于β-葡萄糖苷酶在复合纤维素酶中的含量较低,而β-葡萄糖苷酶是各组分酶水解协同作用的最后关键一步,因此以β-葡萄糖苷酶为补充酶,与2.5倍量的纤维素酶共同固定化后进行水解,其在24 h后达到平衡的糖化率是单独的固定化纤维素酶水解的近3倍,且重复水解反应8次后,依然有61%的糖化率。β-葡萄糖苷酶在聚合物PVP保护作用下,与乙酸铜和对氨基苯甲酸(PABA)混合液共沉淀合成基于金属有机框架Cu(PABA)的固定化酶β-G@Cu(PABA)。优化后的乙酸铜和对氨基苯甲酸的浓度分别为50 mM和12.5 mM,共沉淀在pH为7.0的乙酸钠-乙酸缓冲液中进行,酶浓度选择为2 mg/mL,固定化8h后的固载量及保留酶活力达到最佳值,分别为162.95 mg/g和81.89%。Cu(PABA)骨架的三维孔道结构为β-葡萄糖苷酶提供了刚性屏蔽环境,显著提高了其稳定性及有机溶剂耐受性。将β-G@Cu(PABA)和PMAAc-纤维素酶共同催化CMC,并与单独PMAAc-纤维素酶水解进行对比。水解12 h后达到平衡,在纤维素酶等量条件下,两种固定化酶共同水解的糖化率较单独固定化PMAAc-纤维素酶提高近一倍,水解循环8次后,得到超过70%的糖化率。
【学位单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TQ925
【部分图文】：

图 1.1 纤维素结构[6]Fig. 1.1 Structure of cellulose[6]素酶素酶简介酶成功应用到商业市场已有 30 余年，对纤维素酶的基础研究在食品、动物饲料、酿造、纺织等多个行业具有很大的应用潜力为生物催化剂酶解纤维素释放的葡萄糖是生产生物乙醇的主复合纤维素酶所组成的内切及外切葡聚糖酶和 β-葡萄糖苷酶β-(1-4)-糖苷键连接而成的纤维素先分解成纤维低聚糖和纤维二糖[13]。复合纤维素酶的生物质转化过程受多方面因素影响，包定性，产物的抑制作用，协同作用的组分酶含量，与底物结合

纤维素酶的热保护及其固定化技术研究图 1.2（a）[22]。来源于真菌的内切葡聚糖酶的 CBD 区由成 β-三明治形，如图 1.2（b）。外切葡聚糖酶的 CBD 结解其氢键，从而降低结晶度生成短纤维，为内切葡聚糖酶单独的 CBD 结构不能独立完成这一复杂水解过程[23]。

图 1.2 CBD 的骨架结构[22]Fig. 1.2 Structure of CBD[22]功能区（CD）[24]3（A），内切葡聚糖酶的 CD 活性部位展开呈现出一条明显着较多的非极性基团，增强了其疏水性，其中也包含少量要用于与底物结合进行催化作用。底物与 CD 的活性部位，促进纤维素酶与底物接触，从而有利于对非结晶区的糖BH 作用提供低聚糖和新的还原末端。如图 1.3（B），外位为一条孔道，其有利于纤维素的单链顺利穿过，并且区进行持续性催化。
【参考文献】

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1 高培基,陈冠军,汪天虹,张颖舒,刘洁;微紫青霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶(CBHI)的纤维素结合结构域及其链结区非水解性破坏纤维素结晶区结构(英文)[J];生物化学与生物物理学报;2001年01期

2 阎伯旭,齐飞,张颖舒,高培基;纤维素酶分子结构和功能研究进展[J];生物化学与生物物理进展;1999年03期

本文编号：2865386