谷氨酸棒状杆菌ATCC 14067中阻遏蛋白ArgR的克隆表达及生物学功能的初步分析
发布时间：2020-11-01 20:51
L-精氨酸已被证明是一氧化氮(NO)的前体,而NO有放松和扩张血管等功能,因此L-精氨酸可用于许多临床领域,近年来受到越来越多的关注。谷氨酸棒状杆菌ATCC 14067是一种无芽孢的革兰氏阳性菌,是多种氨基酸包括精氨酸的重要生产工业菌种,且符合食品安全要求。ArgR是谷氨酸棒状杆菌中精氨酸生物合成途径中的一个重要调控蛋白,但其具体调节机制尚不十分清楚。目前谷氨酸棒状杆菌ATCC 14067的全基因组测序已经完成,基于这些数据,可以用转录组测序技术(RNA-seq)测序获得的转录组结果进行定量和功能关联分析,以期筛选出一些可能为ArgR潜在的靶标基因,为ArgR的调控机制深入研究提供线索。并利用凝胶阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)对获得的结果进行验证。具体研究内容及结果如下:(1)C.glutamicum ATCC 14067来源的 ArgR 的克隆与表达构建重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET22b-argR,诱导表达ATCC 14067来源的ArgR,成功得到目的蛋白。利用Native PAGE及分子筛色谱柱对ArgR蛋白进行分析,结果表明ArgR蛋白相对分子质量在108 kDa左右,在天然状态下ArgR蛋白为六聚体结构。(2)利用RNA-seq技术对ArgR的生物学功能进行一个初步的分析将野生型菌株Cglutamicum ATCC 14067中的基因表达与argR过表达菌株C.glutamicum ATCC 14067/pEC-XK99E-argR以及 ArgR 功能缺失突变菌株C.glutamicum ATCC 14067 ΔargR中的基因表达进行比较。其中最大的基因表达差异出现在C.glutamicum/XK99E与Cglutamicum ΔargR之间,共有487个差异表达基因,其中位于精氨酸操纵子argCJBDFRGH中7个酶的基因的表达差异最大,精氨酸合成的旁路途径中氨甲酰磷酸合成酶编码基因carA,carB的表达量也存在较大差异。这些结果可能表明ArgR的功能缺失解除了对这些基因的阻遏,说明精氨酸生物合成基因的表达有可能受到ArgR的调控。(3)利用凝胶阻滞实验验证ArgR对精氨酸合成相关基因的调控作用合成生物素标记的谷氨酸棒状杆菌ATCC 14067来源的argC,argJ,argB,argF,argG,argH,carA基因片段,采用凝胶阻滞实验(EMSA)观察ArgR蛋白与其在体外的相互作用。结果表明,ArgR蛋白能够在体外与argC、argB、argG、carA基因片段结合,且与argB基因的结合程度最大,说明ArgR蛋白可能通过与这些靶标位点的结合来调控相关基因的转录。
【学位单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TQ922
【部分图文】：
乙酰转移酶的催化下从乙酰鸟氨酸转移到答氨酸，于是乙醜谷氨酸可以再次循环进入??Ｌ－精氨酸的合成过程，在该途径中合成途径第二个酶（乙酰谷氨酸激酶）受到Ｌ－精氨??酸的反馈抑制（．图１－２）。在谷氨酸棒状杆菌中精氨酸的合成存在一条旁路途径，氨甲??酰磷酸可以通过形成瓜氨酸而进入精氦酸合成途径６该反应由氨甲酰磷酸合成酶??（ｃａｒｂａｍｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ?ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＣＰＳ）催化?Ｃ〇２、谷氣酸和?ＡＴＰ?而形成〇．??１．２．２谷氨酸棒状杆菌中与Ｌ－精氨酸生物合成相关的基因??Ｌ－精氮酸生物合成暴些细菌（假单胞菌ｆｔｅＭｔ／ｏｗｃｗａｓ?ｓｐｐ．和蓝藻菌??ａｃｔｅｄ臟ｓｐｐ．）中’３］是分散在染色体ＤＮＡ上的，而在另外一些细菌（结核分枝杆菌??Ｍ祕ｅｆ？／／〇５７＋５和谷氣酸棒状杆菌Ｇ?ｇ／ｗ／猶／ｃ麵）中是成儀集中的［２４’２５］。在谷氨酸棒??状杆菌中，精氨酸生物合成基固簇ａｒｇＣ／ＳＤＥＲＧ汉由８个结构基因组成，该基囡簇：中存??在ａｒｇＣ和ａ，＃？两个趋动子，可以独立转最产：生两个有序排列的操纵子??和〇叹（＾２６］，可编码从谷氨酸到精氨酸代谢合成所必需的所有酶系（图１－３）。在Ｌ－??精氨酸生物合成的经济循环途径中，乙酰谷氨酸激酶（由编码）是精氨酸生物合??成的关键酶，它受到高浓度的Ｌ－精氨酸的反馈抑制。??ａｒｇＣ?ａｒｇＪ?ａｒｇＢ?ａｒｇＤ?ａｒｇＦ?ａｒｇＲ?ａｒｇＧ?ａｒｇＨ??５’?Ｈｌ０７４ｂｐ％—｜?１１６７６？＼－｜９５＾＾?１１７６ｂ＾９６０ｂｐ＾５１６ｂｐ＞—?１４３４ｂｐ＾Ｖ－?３
乙酰转移酶的催化下从乙酰鸟氨酸转移到答氨酸，于是乙醜谷氨酸可以再次循环进入??Ｌ－精氨酸的合成过程，在该途径中合成途径第二个酶（乙酰谷氨酸激酶）受到Ｌ－精氨??酸的反馈抑制（．图１－２）。在谷氨酸棒状杆菌中精氨酸的合成存在一条旁路途径，氨甲??酰磷酸可以通过形成瓜氨酸而进入精氦酸合成途径６该反应由氨甲酰磷酸合成酶??（ｃａｒｂａｍｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ?ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＣＰＳ）催化?Ｃ〇２、谷氣酸和?ＡＴＰ?而形成〇．??１．２．２谷氨酸棒状杆菌中与Ｌ－精氨酸生物合成相关的基因??Ｌ－精氮酸生物合成暴些细菌（假单胞菌ｆｔｅＭｔ／ｏｗｃｗａｓ?ｓｐｐ．和蓝藻菌??ａｃｔｅｄ臟ｓｐｐ．）中’３］是分散在染色体ＤＮＡ上的，而在另外一些细菌（结核分枝杆菌??Ｍ祕ｅｆ？／／〇５７＋５和谷氣酸棒状杆菌Ｇ?ｇ／ｗ／猶／ｃ麵）中是成儀集中的［２４’２５］。在谷氨酸棒??状杆菌中，精氨酸生物合成基固簇ａｒｇＣ／ＳＤＥＲＧ汉由８个结构基因组成，该基囡簇：中存??在ａｒｇＣ和ａ，＃？两个趋动子，可以独立转最产：生两个有序排列的操纵子??和〇叹（＾２６］，可编码从谷氨酸到精氨酸代谢合成所必需的所有酶系（图１－３）。在Ｌ－??精氨酸生物合成的经济循环途径中，乙酰谷氨酸激酶（由编码）是精氨酸生物合??成的关键酶，它受到高浓度的Ｌ－精氨酸的反馈抑制。??ａｒｇＣ?ａｒｇＪ?ａｒｇＢ?ａｒｇＤ?ａｒｇＦ?ａｒｇＲ?ａｒｇＧ?ａｒｇＨ??５’?Ｈｌ０７４ｂｐ％—｜?１１６７６？＼－｜９５＾＾?１１７６ｂ＾９６０ｂｐ＾５１６ｂｐ＞—?１４３４ｂｐ＾Ｖ－?３
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【参考文献】
本文编号：2866081
【学位单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TQ922
【部分图文】：
乙酰转移酶的催化下从乙酰鸟氨酸转移到答氨酸，于是乙醜谷氨酸可以再次循环进入??Ｌ－精氨酸的合成过程，在该途径中合成途径第二个酶（乙酰谷氨酸激酶）受到Ｌ－精氨??酸的反馈抑制（．图１－２）。在谷氨酸棒状杆菌中精氨酸的合成存在一条旁路途径，氨甲??酰磷酸可以通过形成瓜氨酸而进入精氦酸合成途径６该反应由氨甲酰磷酸合成酶??（ｃａｒｂａｍｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ?ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＣＰＳ）催化?Ｃ〇２、谷氣酸和?ＡＴＰ?而形成〇．??１．２．２谷氨酸棒状杆菌中与Ｌ－精氨酸生物合成相关的基因??Ｌ－精氮酸生物合成暴些细菌（假单胞菌ｆｔｅＭｔ／ｏｗｃｗａｓ?ｓｐｐ．和蓝藻菌??ａｃｔｅｄ臟ｓｐｐ．）中’３］是分散在染色体ＤＮＡ上的，而在另外一些细菌（结核分枝杆菌??Ｍ祕ｅｆ？／／〇５７＋５和谷氣酸棒状杆菌Ｇ?ｇ／ｗ／猶／ｃ麵）中是成儀集中的［２４’２５］。在谷氨酸棒??状杆菌中，精氨酸生物合成基固簇ａｒｇＣ／ＳＤＥＲＧ汉由８个结构基因组成，该基囡簇：中存??在ａｒｇＣ和ａ，＃？两个趋动子，可以独立转最产：生两个有序排列的操纵子??和〇叹（＾２６］，可编码从谷氨酸到精氨酸代谢合成所必需的所有酶系（图１－３）。在Ｌ－??精氨酸生物合成的经济循环途径中，乙酰谷氨酸激酶（由编码）是精氨酸生物合??成的关键酶，它受到高浓度的Ｌ－精氨酸的反馈抑制。??ａｒｇＣ?ａｒｇＪ?ａｒｇＢ?ａｒｇＤ?ａｒｇＦ?ａｒｇＲ?ａｒｇＧ?ａｒｇＨ??５’?Ｈｌ０７４ｂｐ％—｜?１１６７６？＼－｜９５＾＾?１１７６ｂ＾９６０ｂｐ＾５１６ｂｐ＞—?１４３４ｂｐ＾Ｖ－?３
乙酰转移酶的催化下从乙酰鸟氨酸转移到答氨酸，于是乙醜谷氨酸可以再次循环进入??Ｌ－精氨酸的合成过程，在该途径中合成途径第二个酶（乙酰谷氨酸激酶）受到Ｌ－精氨??酸的反馈抑制（．图１－２）。在谷氨酸棒状杆菌中精氨酸的合成存在一条旁路途径，氨甲??酰磷酸可以通过形成瓜氨酸而进入精氦酸合成途径６该反应由氨甲酰磷酸合成酶??（ｃａｒｂａｍｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ?ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＣＰＳ）催化?Ｃ〇２、谷氣酸和?ＡＴＰ?而形成〇．??１．２．２谷氨酸棒状杆菌中与Ｌ－精氨酸生物合成相关的基因??Ｌ－精氮酸生物合成暴些细菌（假单胞菌ｆｔｅＭｔ／ｏｗｃｗａｓ?ｓｐｐ．和蓝藻菌??ａｃｔｅｄ臟ｓｐｐ．）中’３］是分散在染色体ＤＮＡ上的，而在另外一些细菌（结核分枝杆菌??Ｍ祕ｅｆ？／／〇５７＋５和谷氣酸棒状杆菌Ｇ?ｇ／ｗ／猶／ｃ麵）中是成儀集中的［２４’２５］。在谷氨酸棒??状杆菌中，精氨酸生物合成基固簇ａｒｇＣ／ＳＤＥＲＧ汉由８个结构基因组成，该基囡簇：中存??在ａｒｇＣ和ａ，＃？两个趋动子，可以独立转最产：生两个有序排列的操纵子??和〇叹（＾２６］，可编码从谷氨酸到精氨酸代谢合成所必需的所有酶系（图１－３）。在Ｌ－??精氨酸生物合成的经济循环途径中，乙酰谷氨酸激酶（由编码）是精氨酸生物合??成的关键酶，它受到高浓度的Ｌ－精氨酸的反馈抑制。??ａｒｇＣ?ａｒｇＪ?ａｒｇＢ?ａｒｇＤ?ａｒｇＦ?ａｒｇＲ?ａｒｇＧ?ａｒｇＨ??５’?Ｈｌ０７４ｂｐ％—｜?１１６７６？＼－｜９５＾＾?１１７６ｂ＾９６０ｂｐ＾５１６ｂｐ＞—?１４３４ｂｐ＾Ｖ－?３
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【参考文献】
相关期刊论文 前2条
1 尹海权;王明召;;分离DNA的琼脂糖凝胶电泳技术[J];化学教育;2012年12期
2 王昕;;高效液相色谱研究进展[J];光明中医;2011年01期
相关硕士学位论文 前1条
1 袁永;钝齿棒杆菌ArgR的凝胶阻滞实验及单增李斯特菌actA、inlB、p60表达载体的构建[D];南昌大学;2012年
本文编号：2866081
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