产β-1,3—葡聚糖酶放线菌的分离及酶基因克隆表达

发布时间：2020-11-01 21:48

　　 β-1,3-葡聚糖酶是降解β-1,3-葡聚糖产生具备药理活性的β-葡聚糖寡糖的有效酶工具。茯苓中多糖水解成寡糖具有抗肿瘤及免疫调节活性,利用β-1,3-葡聚糖酶可水解茯苓中β-1,3-糖苷键为主链的可溶性或不可溶性多糖,形成寡糖进而促进生物活性。因此,筛选产β-1,3-葡聚糖酶菌株、研究β-1,3-葡聚糖酶降解茯苓多糖的应用具有一定的意义与价值。论文基于高通量测序技术的应用,调查了土样中微生物群落的分布及多样性;从土样中分离分泌葡聚糖酶的菌株并鉴定;利用分子手段获得β-1,3-葡聚糖酶探究了其对茯苓多糖的降解;取得了以下主要结论:(1)高通量测序数据的分析结果显示,茯苓培植土(FTL_1)中放线菌门(Actinobacteria)所占比例为18.64%,其丰度仅次于变形杆菌门(Proteobacteria),且放线菌门中链酶菌属(Streptomyces)和节杆菌属(Arthrobacter)各占比为1.90%和0.78%。因此本研究确定从FTL_1筛选降解β型葡聚糖放线菌。(2)选用相应的筛选培养基,从FTL_1中分离了58株放线菌,其中11株具有β-1,3-葡聚糖酶活性。首次发现和报道了来自北里孢菌属(Kitasatospora)菌株SYBCQL具有β-1,3-葡聚糖酶活性。来自链酶菌属的菌株SYBC17产酶活力最高,为1.02 U·mg~(-1)。应用菌株SYBC17发酵了茯苓,最佳发酵时间为96 h,此时SYBC17对茯苓中多糖的降解效果最好。(3)克隆和分析了菌株SYBC17的两个编码β-1,3-葡聚糖酶的基因17-W和17-Q,菌株SYBCQL的基因QLK1,在分子水平验证了分离的菌株产β-1,3-葡聚糖酶。重组酶QLK1,17-W和17-Q的酶活性分别为65.82 U·mg~(-1),132.90 U·mg~(-1)和14.70 U·mg~(-1)。重组酶17-W产率最高。(4)生物信息学分析显示,三个酶蛋白全为糖苷水解酶家族16,分别由一个催化结构域及一个碳水化合物结构域组成,其中QLK1与17-W的碳水化合物结构域为CMB13,而17-Q对应结构域为CMB6。三个同源建模的酶蛋白与β-葡寡糖四糖成功实现分子对接,β-葡寡糖四糖均出现在催化活性中心的底物结合区。(5)酶学性质研究发现,QLK1的最适温度是60°C,17-W和17-Q的最适作用温度均为55°C。QLK1和17-Q的最适pH是5.5,而17-W的最适pH是6.0,三个酶的热稳定性和pH稳定良好;三个重组酶对底物的亲和力由大到小的排序依次是17-W、QLK1、17-Q。(6)TLC分析重组酶对茯苓多糖的降解作用显示,重组酶17-W降解后主要产生两种类型的寡糖,17-Q降解后主要产生三种类型的寡糖。
【学位单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q78;TQ920.1
【部分图文】：

第一章 绪论architecture) 如图 1-2，其中两个 β-折叠组成的片层分别各自由 6~7 条反向且平行的 β-链构成两个反向平行的 β-片层结构十分保守，构成 β-片层结构的 β-折叠链的长度和弯曲度均基本致。β-折叠形成的片层弯曲形成的空隙使酶蛋白分子在表面形成了凹面和凸面，酶蛋白分的凹面一侧是具有两个残基为催化活性中心 (E123 和 E128) 的底物结合区，催化域结构高保守。一部分酶蛋白的凸侧中有一个 Ca2+结合位点，均是由相距较近的 Glu14 和 Gly58 两个距离较远的 Asp237 的羰基氧(骨架羰基氧和羰基侧链氧)与钙离子相互作用，起到了稳蛋白结构的功能如图 1-2(A)。还有一部分酶蛋白的凸侧存在一个 Mg2+结合位点代替 Ca2+结位点，这个结合位点是由两个相距较近的 ASP16 和 Gly66 氨基酸残基 分别与 Asp269 的架羰基以及羧基氧，还有 Asp237 的羰基侧链氧、水分子，共同与镁离子相互作用。据以所述，金属阳离子存在于酶催化凸面，而底物却与酶沿着空间距离比较远的凹面相互结合说明金属离子 Ca2+及 Mg2+对酶的催化作用无直接影响[33, 34]。此外在图 1-2(B)的 β-1,3-葡聚酶在Cys161-Cys169和Cys181-Cys186的位置存在两个二硫键也对蛋白结构的稳定作用有关但此结构在 BglF 的结构并没有发现 (图 1-2(A))。

图 1-1 茯苓菌核中多糖的提取Fig. 1-1 Extraction of polysaccharides from the P. cocos sclerotium多糖及其复合物(脂多糖、蛋白多糖)的防御病毒、降低血压和血脂、多方面的药理作用[55-58]。此外，多糖无毒副作用，安全系数高。因此中主要的多糖来源其在临床上得以成功应用。但是从茯苓中提取的多在生物体内不易被消化和吸收利用，造成大规模的临床应用未能实现通过对茯苓中的多糖进行改性来增加其溶解性、提高它的生物活性。物法、物理法、化学法三种方法为主。其中对多糖结构进行化学修饰其工艺流程繁琐，无法大批量生产。Hamuro 等[59]根据液相、固相两相成了水溶性的羧甲基茯苓多糖 (CMP)。生物降解则是利用外源酶与多降解的作用，该方法高效、专一性强、且无副反应。通过酶对天然多常因分子量过大、溶解性低和黏度高等影响造成其在临床上的应用范挥。因此酶降解是一种多糖改性的主要手段，具有十分大的潜在应用不溶性 β-1,3-葡聚糖发挥药理活性，利用 β-1,3-葡聚糖酶水解作用可使和抗肿瘤性质的寡糖，有效提高多糖的生物活性及药用价值[60, 61]。

酶作用于茯苓中多糖的降解情况，并将降解葡聚糖重组酶与小分子寡糖的进行对接后续重组酶产酶优化及茯苓中多糖的生物活性及研究铺垫。论文研究内容文从以下方面开展研究：1) 利用高通量测序分析茯苓培植土及非培植土的土样群落组成，确定在茯苓培植土 β-1,3-葡聚糖酶能力的优势菌群为放线菌。2) 从茯苓培植土中优先筛选放线菌，再从分离的放线菌中筛选产 β-1,3-葡聚糖酶菌株3) 将在放线菌中编码 β-1,3-葡聚糖酶基因扩增后在宿主中表达，并利用镍柱进行酶纯纯度的 β-1,3-葡聚糖酶重组酶。4) 对 β-1,3-葡聚糖酶进行同源建模并与 β-葡寡糖四糖进行分子对接。5) 研究重组酶的酶学性质。6) 利用分离的产 β-1,3-葡聚糖酶菌株发酵茯苓及重组酶作用于茯苓多糖降解产物分析对茯苓中多糖的降解。
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本文编号：2866146