混菌固态发酵毛榛仁粕制备降血压肽及其纯化与结构鉴定

发布时间：2020-11-05 16:10

　　 毛榛(Corylusmandshurica Maxim.)榛仁粕是生产榛仁油的副产物,更是一种优质的植物蛋白源。目前其利用率较低,常被作为饲料或肥料低价出售,榛仁粕的开发利用可以大大提高毛榛的附加值。本文以脱脂的毛榛仁粕为原料,采用混菌固态发酵法制备降血压肽,筛选最佳发酵菌种组合并优化其发酵工艺。将制备的降血压肽进行分离纯化,并对其降血压效果最佳的组分进行氨基酸序列鉴定。最后通过细胞试验验证了毛榛仁粕降血压肽的功能。1、通过对毛榛仁粕基本成分的测定,毛榛仁粕中蛋白质含量高达51.19 g/100g,其还原糖含量较高,可以满足微生物发酵所需的碳源和氮源,是较好的生物活性肽制备原料,而且可以作为固态发酵的原料。采用固态发酵的方法,以蛋白酶活力、水解度、粗多肽得率为指标筛选蛋白酶产量较高的菌株。结果表明枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、米曲霉更适合固态发酵榛仁粕;将三种菌株等比接种量两两混合,在一定的条件下对毛榛仁粕进行发酵,发现采用枯草芽孢杆菌和米曲霉组合菌株发酵产物的ACE抑制率、水解度和粗多肽得率较高,分别为22.11%、21.74%和19.66%,确定枯草芽孢杆菌和米曲霉组合菌株为混菌固态发酵的最佳菌种组合。2、在确定混菌固态发酵的最佳菌种组合的基础上,通过单因素试验和正交试验对固态发酵毛榛仁粕制备降血压肽的发酵工艺进行优化,优化后的最佳工艺条件为枯草芽孢杆菌和米曲霉菌种比例2:3,接种量15%,水分含量60%,发酵温度40℃,发酵时间72 h。在此条件下发酵样品的ACE抑制率、水解度及粗多肽得率分别为45.24%,30.13%和 25.53%,其中 ACE 抑制率提高了 104.60%。3、将微生物法制备的毛榛仁降血压肽进行分离纯化,通过超滤法,得到发酵产物的多肽提取液3个组分,其中组分1(3 KD)的ACE抑制活性最高;进一步采用葡聚糖凝胶(SephadexG-25)对组分1中的多肽进行二次纯化,葡聚糖凝胶色谱的最佳分离工艺.:去离子水作为洗脱剂、样品浓度为50mg/mL(上样体积1.00mL)、洗脱流速为0.4mL/min的条件下,毛榛仁ACE抑制肽分成3个不同组分。其中G-2组分的ACE抑制抑制率最高达75.46±0.72%,较超滤后的组分1的ACE抑制率提高了 20.06%。4、将G-2组分通过纳升级液相色谱-质谱(Nano-UPLC-MS)检测,鉴定其氨基酸序列,通过与BIOPEP数据库对比得到4个多肽,Ala-Ser-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn-Val-Leu(ASFLLRNVL)、Ile-Asp-Tyr-Pro-Asn-Val-Leu-Arg(IDYPNVLR)、Ala-Pro-Leu-Lys-Ala-Phe-Gly-Arg-Thr(APLKAFGRT)、Lys-Lys-Lys-Pro-Glu(KKKPE)分子量分别为1031.6128Da、988.5342Da、959.5552Da、628.3907Da。未匹配的多肽通过DeNovo蛋白质测序分析法检测发现G-2组分中还有61条具有6～14个氨基酸的短链肽,其分子量均小于1.5 KD,经过氨基酸组成分析发现其序列中具有大量的疏水性氨基酸、碱性氨基酸和芳香族氨基酸,占总氨基酸数的59.97%。由此证明毛榛仁降血压肽是具有ACE抑制肽特征的多肽。5、利用纯化后G-2组分进行细胞实验,对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)进行培养观察,并测定培养液中NO、ET的释放量,结果显示添加毛榛仁降血压肽能促进人脐静脉内皮细胞释放NO,而降低ET的释放。证明毛榛仁降血压肽降血压肽在一定浓度范围具有降血压药物卡托普利类似的降血压作用。
【学位单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TQ920.1;TQ464.7
【部分图文】：

２．４．３发酵菌种的筛选??２．４．３．１蛋白酶活力标准曲线的建立??利用福林法测定蛋白酶活力的标准曲线如图２－２，其回归方程为：ｙ?＝?〇．〇ｌ〇ｘ?＋??０．００４４，方程的拟合度Ｒ２＝０．９９９３。??０．＃牐颍崳?０．５?■??ｍ?０．４?■??ｌ。３??Ｓ?Ｑ．２?■??ｙ?＝?０．?０１０ｌｘ?＋?０．?００４４??＇?Ｒ２?＝?０．９９９３??〇?＊?？?１?？?１?？?１?■?？?■?？?？?■??０?１０?２０?３０?４０?５０?６０??氣酸浓度（ｋｇ／ｍｌ）??图２－２蛋白酶活力标准曲线??Ｆｉｇ．２－２?Ｐｒｏｔｅａｓｅ?ａｃｔｉｖｉｔｙ?ｓｔａｎｄａｒｄ?ｃｕｒｖｅ??２．４．３．２菌种的筛选??单一菌种发酵榛仁粕后所产蛋白酶活力、产物水解度和粗多肽得率如图２－３所示。??３?＂，?３０?ｎ?１２??－獅？?ａ?：卞?炫〕水解沒?＇?－１１??ｎａ?；：＂＞?Ｋ?ｍｍｍ：２６?：⑴??ｍ?〇?４ｂ?－??＊?ｒ?ｐ?ｄ?｜ｂ??＿暴＿＿?＿；ｒ：：ｓ??ｉ：??菌种??字母不同表示差异显著（ｐ＜〇．〇５）??图２－３单菌发酵结果??Ｆｉｇ．２－３?ｓｉｎｇｌｅ?ｂａｃｔｅｒｉａ?ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ?ｒｅｓｕｌｔｓ??－１７－??

??如图２－３可以看出，在接种量和发酵时间相同的情况下不同菌种所产生的蛋白酶活??力有较大的差别，其中枯草芽孢杆菌最高达２７７３?Ｕ／ｇ；米曲霉次之达１２３６?Ｕ／ｇ；地衣芽??孢杆菌和植物乳杆菌差异不显著，分别为８１５?Ｕ／ｇ、７９９?Ｕ／ｇ，酿酒酵母最低为５０２?Ｕ／ｇ。??不同菌种发酵后产物的水解度差异显著，枯草芽孢杆菌最高达２３．６％；米曲霉次之??达２１．６４％；地衣芽孢杆菌和植物乳杆菌水解度分别为１９．１１％、１６．６８％；酿酒酵母最低??为１４．８２％；粗多肽得率差异显著，枯草芽孢杆菌组粗多肽得率最高达１１．４５％；米曲霉??次之达７．５４％；地衣芽孢杆菌和植物乳杆菌分别为６．７７％、５．２１％，酿酒酵母最低为??４．７４％?〇??综合对比水解度、粗多肽得率、酶活三个指标，枯草芽孢杆菌为最佳菌株，其次分??别为米曲霉和地衣芽孢杆菌，植物乳杆菌虽然与地衣芽孢杆菌酶活力相当，但是粗多肽??得率和水解度均低于地衣芽孢杆菌。因此确定枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和米曲霉为??榛仁柏固态发酵的适宜菌种。??２．４．４混菌发酵??混合菌种发酵榛仁粕后产物的ＡＣＥ抑制率、水解度和粗多肽得率如图２－４所示。??ｅｚｚ］??＿?ＡＣＥ抑制率??ｈ?ａ??．ｒ

３．３结果分析及讨论??３．３．１菌种比例对降压肽制备的影响??枯草芽孢杆菌与米曲霉的接种比例对降血压肽制备的影响如图３－１。??２５「?…Ａ?１６．５?ｎ２５??１?一▲一水銲度?■?．??忒‘一?■——多肽得率?Ｉ?：?１６０??．２０：?／Ｖ?；／?＼＼?：，４?气二＇??ｇｗ：?＇／／／?■?＼＞?－？＾ｒ２２ｉ?．??！６；?／?－?１２．５?＾?＾??１５?－?－?１２．０?？〇??１４?：?２?＾?：丨卜??１３?－?．?＾??１２?１?－?■！？０?－?｜９??ｊ?｜?－?￣?１０，５?＇??１０??ｉ???５?＊?１???１?？?１??１０．０?」ＩＳ??２：！?３：?２?１：１?２：３?１：?２??菌种比例（钴草芽孢杆菌：米＿霉）??图３－１不同接种比例对发酵的影响??Ｆｉｇ．３－１?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｉｎｏｃｕｌｕｍ?ｒａｔｉｏ?ｏｎ?ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ??－２２－??
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本文编号：2871872