基于改造谷氨酸棒杆菌转氨基途径优化L-亮氨酸的生产性能

发布时间：2020-11-06 15:44

　　 在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中的L-亮氨酸合成途径中,最后一步反应是由支链氨基酸转氨酶(BCAT)催化的氨基转移反应。然而BCAT同时催化三种支链氨基酸(BCAAs)与相应α-酮酸之间的氨基转移反应,造成了另外两种BCAAs始终以副产物的形式存在于发酵液中,为后续分离提取增加了难度。所以本文以L-亮氨酸产生菌C.glutamicum FA-1为出发菌株,通过改造转氨基途径筛选对L-亮氨酸有特异催化合成活性的转氨酶,考察其对L-亮氨酸的作用。主要研究结果如下:(1)通过同源重组原理敲除出发菌株C.glutamicum FA-1中编码BCAT的ilv E基因,研究其对L-亮氨酸和L-缬氨酸合成的影响。与出发菌株C.glutamicum FA-1相比,重组菌株C.glutamicum FA-1Δilv E的葡萄糖平均消耗速率大大降低,并且L-亮氨酸和L-缬氨酸的产量分别降低了87.1%和92.4%,而丙酮酸等副产物由于代谢通路的阻断而增加。另外,BCAT的失活导致重组菌株对L-亮氨酸和L-缬氨酸的酶活力分别降低了94.4%和93.0%,但是重组菌株只表现出L-缬氨酸营养缺陷,由此猜测体内存在其他的转氨酶参与L-亮氨酸的合成以满足菌株正常生长的需求。(2)为验证重组菌株体内仍有其他转氨酶参与L-亮氨酸的合成,克隆及表达C.glutamicum来源的8种转氨酶基因,结果发现只有重组菌株C.glutamicum FA-1Δilv E/p EC-XK99E-asp B表现出L-亮氨酸催化合成活性,L-亮氨酸的产量达20.81 g·L-1,并且不影响L-缬氨酸的合成。与对照菌株C.glutamicum FA-1Δilv E相比,L-亮氨酸的酶活力提高了537%,证实了在ilv E-菌株体内,确实存在着除BCAT外的催化L-亮氨酸合成的转氨酶。由此推测C.glutamicum FA-1Δilv E的正常生长不依赖于L-亮氨酸可能是由于asp B基因的存在,其在体内催化合成L-亮氨酸,可以满足菌株生长的需求而不需要额外添加。(3)通过构建ilvE-aspB-双突变体菌株,研究其对L-亮氨酸合成的影响。结果显示双突变体菌株C.glutamicum FA-1ΔilvE ΔaspB不再具有L-亮氨酸催化合成活性,并且表现出L-天冬氨酸和L-亮氨酸双重缺陷,证明C.glutamicum FA-1ΔilvE的正常生长不依赖于L-亮氨酸是由于aspB基因的存在,其可以满足菌株正常生长对L-亮氨酸的需求。由于BCAT和AspB的失活扰乱了糖酵解途径和TCA循环,使得菌体的生长及代谢缓慢,副产物(L-丙氨酸、L-谷氨酸和丙酮酸)含量有所增加,但L-缬氨酸产量不受影响。由于重组菌株C.glutamicum FA-1ΔilvE ΔaspB消除了体内L-亮氨酸的影响,对下一步筛选特异性的转氨酶提供了基础,用于下一步实验。(4)为筛选出对L-亮氨酸具有特异催化合成活性的转氨酶,在双突变体菌株中克隆及表达26种外源转氨酶基因,结果表明转氨酶Ectyr B和Ecavt A分别仅具有L-亮氨酸和L-缬氨酸催化合成活性,并且重组菌株FA-1Δilv EΔasp B/p EC-XK99E-Ectyr B发酵生产L-亮氨酸的产量为18.55 g·L-1;另外,来源不同的BCATs均具有L-亮氨酸和L-缬氨酸催化合成活性,并且它们的催化能力相近,而其他的转氨酶未检测到L-亮氨酸和/或L-缬氨酸催化合成活性。(5)通过对所使用的转氨酶蛋白进化分析及序列比对,结果表明所有的BCATs位于进化树的同一分支,亲缘关系较近,并且推测的酶活性位点及结合底物和辅助因子的位点一致;另外EctyrB位于单独的一个分支,与其他的转氨酶亲缘关系比较远;而CgaspB与其他AspATs位于不同的分支,并且通过序列比对发现CgaspB与其他AspATs的活性位点一致,但结合底物及辅助因子PLP的残基是独特的,它们之间的亲缘关系比较远。由于CgaspB和EctyrB具有专一的L-亮氨酸催化特性,因此它们可以用于构建L-亮氨酸产生菌,优化L-亮氨酸的生产。
【学位单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TQ922
【部分图文】：

图 3-3 目的重组菌株的筛选及验证Fig. 3-3 Screening and verification of recombinant strain C.glutamicumFA-1ΔilvE 的筛选，B 重组菌株 C.glutamicumFA-10 DNAMarker，1 1#单菌落，2 2#单菌落，3 3#单菌落，4 4#单菌落，-L 和 ilvE-R 为引物，菌落为模板扩增片段；图 B 中 M DL10000 D#

图 3-6 重组质粒的单、双酶切琼脂糖凝胶电泳图Fig. 3-6Agarose gel electrophoresis of different recombinant plasmids000 DNA Marker，1-2 pEC-XK99E-Cgl0814 单、双酶切产物，3-4 pEC-X5-6pEC-XK99E-avtA 单、双酶切产物，7-8pEC-XK99E-Cgl2309 单、双酶Cgl2844 单、双酶切产物，11-12 pEC-XK99E-aroT 单、双酶切产物，13-1

pK18mobsacB-ΔaspB 单、双酶el electrophoresis of plasmid pKAMarker，1-2 pK18mobsacB- FA-1 ΔilvE ΔaspB 的构建A-1 ΔilvE ΔaspB 的构建依。结果如图 3-10 所示，表
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本文编号：2873328