扇贝裙边ACE抑制肽的分离纯化及活性研究

发布时间：2020-11-12 12:51

　　 本文为了提高扇贝裙边的高值化利用,通过蛋白酶酶解扇贝裙边工艺的优化,再对酶解物分离纯化获得ACE抑制肽的结构,并通过高血压动物模型试验,验证酶解物的降血压效果。主要研究内容和结果如下:1.以扇贝裙边为原料,探究了胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶及碱性蛋白酶酶解产物的ACE抑制活性,其中木瓜蛋白酶的酶解产物ACE抑制率最高,为71.25%;根据单因素和正交试验结果,确定木瓜蛋白酶酶解扇贝裙边最佳酶解工艺条件为料液比(g/mL)1:3,加酶量2.0%,酶解温度60℃,酶解时间1 h,pH 7.0。2.扇贝裙边酶解物冷冻干燥后,经Sephadex LH-20层析柱分离得到七个组分峰,其中F5、F6、F7具有ACE抑制活性,进而通过RP-HPLC(20%乙腈)洗脱后,得到F5-3、F7-2、F7-4具有ACE抑制活性;再次通过RP-HPLC(10%乙腈)进一步纯化后,确定F5-3-3、F7-4-3具有ACE抑制活性,而F7-2洗脱出的八个信号组分均具有ACE抑制活性;最后对F5-3-3进行质谱鉴定,获得ACE抑制肽的序列为Val-Trp(VW),分子量303.17 Da,通过合成后测定其IC_(50)为86.9μmol/L。3.对扇贝裙边来源的ACE抑制肽进行降血压活性测定。通过超滤膜将扇贝裙边酶解液截留成不同分子量范围的样品,其中分子量范围为3 KDa~1 KDa酶解产物的ACE抑制活性更高,其IC_(50)值为0.88 mg/mL,将该部分活性肽以灌胃方式给药SHR大鼠,通过尾套法测定SBP,结果显示,活性肽可显著降低SHR的SBP,在给药9天(172±7 mmHg)后,同空白对照组的SBP相比一直表现出极显著性差异(P0.01),在第28天时其SBP降低到161±3 mmHg,但SHR的SBP高于阳性对照组;在停药后第7天酶解物组SHR的血压为169±5 mmHg,同空白对照组的SBP相比仍都表现出了极显著性差异(P0.01);同时扇贝裙边活性肽对SHR大鼠的体重增长也有一定的促进作用。第28天停药后,对SHR血清中ACE,AngⅡ,ATG,ALD进行测定,发现ACE,AngⅡ,ATG活性及ALD的含量低于空白对照组;而相对于阳性对照组,酶解物组SHR血清中ACE,AngⅡ,ATG的表达水平略高,但ALD的表达水平相对降低。
【学位单位】：大连海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TQ936.16
【文章目录】：
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摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1.1 扇贝
        1.1.1 扇贝简介
        1.1.2 扇贝裙边的营养价值
        1.1.3 扇贝裙边的加工利用现状
    1.2 生物活性肽
        1.2.1 生物活性肽的概念
        1.2.2 贝类蛋白源生物活性肽的研究现状
    1.3 高血压与ACE抑制剂
        1.3.1 ACE抑制肽降压机制
        1.3.2 ACE抑制肽的提取方法
        1.3.3 ACE抑制肽的分离纯化
        1.3.4 ACE抑制肽的结构鉴定
        1.3.5 ACE抑制肽的活性评估
        1.3.6 ACE抑制肽的构效关系
    1.4 本课题的研究目的与意义
    1.5 本课题的主要研究内容
第二章 扇贝裙边ACE抑制肽的酶解工艺优化
    2.1 材料与试剂
        2.1.1 实验原料
        2.1.2 主要实验试剂
    2.2 主要仪器设备
    2.3 实验方法
        2.3.1 ACE抑制活性的测定
        2.3.2 基本成分测定
        2.3.3 脱盐工艺
        2.3.4 蛋白酶的筛选
        2.3.5 单因素试验
        2.3.6 正交试验
    2.4 结果与讨论
        2.4.1 基本成分分析
        2.4.2 脱盐工艺
        2.4.3 蛋白酶的筛选
        2.4.4 单因素试验
        2.4.5 正交试验
        2.4.6 验证试验
第三章 扇贝裙边ACE抑制肽的分离纯化
    3.1 材料与试剂
        3.1.1 实验材料
        3.1.2 主要实验试剂
    3.2 主要实验仪器
    3.3 实验方法
        3.3.1 扇贝裙边酶解产物的制备
        3.3.2 SephadexLH-20层析柱对酶解产物的分离
        3.3.3 反高效液相（RP-HPLC）对活性组分的纯化
        3.3.4 ACE抑制肽氨基酸残基序列的鉴定
    3.4 结果与讨论
        3.4.1 SephadexLH-20层析柱对酶解产物的分离
        3.4.2 RP-HPLC对活性组分的纯化
        3.4.3 ACE抑制肽氨基酸残基序列的分析
第四章 扇贝裙边ACE抑制肽降血压活性研究
    4.1 材料与试剂
        4.1.1 实验材料
        4.1.2 主要实验试剂
    4.2 主要实验仪器
    4.3 实验方法
        4.3.1 样品制备
        4.3.2 实验动物分组
        4.3.3 心脏收缩血压测定方法
        4.3.4 SHR血清中RAS系统中相关成分测定
        4.3.5 实验数据统计学处理方法
    4.4 结果与讨论
        4.4.1 灌喂样品的IC50值
        4.4.2 SHR体重的变化情况
        4.4.3 SHR的SBP变化情况
        4.4.4 SHR血清中RAS系统中相关指标的影响
第五章 结论与展望
参考文献
攻读硕士期间发表的学术论文
致谢

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本文编号：2880768