gndL与2kgdH基因双敲除对变形假单胞菌葡萄糖酸合成的影响

发布时间：2020-11-15 15:54

　　 本论文通过敲除膜结合葡萄糖酸脱氢酶(gluconate dehydrogenase,GADH)和2-酮基葡萄糖脱氢酶(2-ketoglucose dehydrogenase,2KGDH)的基因,验证其在变形假单胞菌生物合成2-酮基葡萄糖酸(2-ketogluconic acid,2KGA)中的作用,同时尝试构建以变形假单胞菌为底盘细胞的生产葡萄糖酸(gluconic acid,GA)的工程菌株。GA是一种具有多种物理和化学特性的有机酸,广泛应用于食品、饮料、化工、制药、纺织、皮革、建筑等行业。本论文以国内2KGA工业生产用菌变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)JUIM01为研究对象,首先利用LA-PCR(Long and accurate polymerase chain reaction)技术克隆编码GADH的gad操纵子的全长序列,利用在线工具对其进行生物信息学分析;其次,利用重叠PCR、无痕敲除和同源重组技术,分别构建gad操纵子结构基因gndS、gndL和gndC缺失菌株JUIM01ΔgndS、JUIM01ΔgndL和JUIM01ΔgndC;最后,在JUIM01ΔgndL的基础上,敲除编码2KGDH的基因2kgdH,构建gndL与2kgdH基因双敲除菌株JUIM01ΔgndLΔ2kgdH,并对原始菌株和基因敲除菌株的2KGA发酵特性进行比较,从而确定变形假单胞菌2KGA的合成途径,同时也为葡萄糖酸高效生产工程菌株的构建提供一定理论依据。主要研究结果如下:(1)利用LA-PCR技术,从变形假单胞菌JUIM01中克隆了含有gad操纵子全长序列的4112 bp的核酸片段。经分析,gad操纵子具有三个结构基因gndS、gndL和gndC,核苷酸序列长度分别为753 bp、1788 bp和1314 bp,分别编码膜结合GADH的小亚基(GndS)、脱氢酶亚基(GndL)和细胞色素c亚基(GndC)。变形假单胞菌gad操纵子的转录起始位点位于其结构基因gndS上游80 bp处的非编码区中,-10区被预测为5′-GTCTAAGCT-3′,-35区被预测为5′-TTGTTC-3′;终止子区处于其下游的非编码区中,终止子为富含GC的反向重复序列,能够形成发夹结构(GGGCCGC-nt4-GCGGCCC)。(2)构建了基因敲除菌株JUIM01ΔgndS、JUIM01ΔgndL和JUIM01ΔgndC。发酵试验结果表明:基因gndS或gndC的敲除对变形假单胞菌的2KGA和GA的生产能力没有影响,基因gndL的敲除仅使其2KGA的生产水平降低了15%,这表明在变形假单胞菌JUIM01中可能存在其它的2KGA合成通路。(3)构建了基因敲除菌株JUIM01Δ2kgdH和JUIM01ΔgndLΔ2kgdH。发酵试验结果表明:基因2kgdH的敲除使变形假单胞菌的2KGA的最高产量降低了5.4%;gndL和2kgdH基因的双敲除使变形假单胞菌的2KGA合成途径得以阻断,从而使大量的GA(57.14 g/L)积累于发酵液中。
【学位单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TQ921.2
【部分图文】：

图 1.1 葡萄糖酸的化学结构式 1.1 Chemical structure of glucon法及研究现状、药品、食品以及饮料产品的产的有机酸已经成为全球市场悠久的历史，于 1870 年被olliard 在丝状真菌黑曲霉的体上可分为化学合成法、微生 GA即在金属催化剂存在的条件境下，利用 Pt、Pd 和 Au 纳米以在多相体系中催化氧化葡

图 1.2 常规的葡萄糖酸生产流程Fig. 1.2 Conventional gluconic acid production proces应用及发展前景羟基和羧基的多功能聚羟基烃碳酸和温和酸，GA 及其盐类（如碱金属盐尤其是其钠盐）和葡萄、制药、纺织、洗涤剂、皮革、摄影、建筑等行具有低毒性、低腐蚀性以及能够与二价和三价金等特点，葡萄糖酸钠已被美国食品和药物管rug Administration，US-FDA）认定为 GRAS（Gene认的安全的食品添加剂[2]。性质在于它具有极强的与钙、铁、铜、铝及其他性和浓碱溶液中，超过了其他已知的螯合剂如 ED

图 1.3 假单胞菌中 2KGA 的合成代谢与分解代谢途径Fig. 1.3 The anabolism and catabolism pathway of 2KGA in Psedomonas1.2.3 膜结合 GADH 的相关研究1.2.3.1 膜结合 GADH 的来源膜结合 GADH 存在于很多氧化型细菌的细胞质膜中，如假单胞菌（Pseudomonas）、欧文氏菌（Erwinia）、克雷伯氏菌（Klebsiella）、葡糖杆菌（Gluconobacter）、醋酸杆菌（Acetobacter）、沙雷氏菌（Serratia）等[73]。可催化的反应为：GA+电子受体→2KGA+还原性电子受体。1.2.3.2 膜结合 GADH 的结构和功能Shinagawa 等[74]从粘质沙雷氏菌（S. marcescens）IFO 3054 中纯化了 GADH，由三个分子质量分别为 68000 Da、52500 Da 和 15500 Da 的亚基组成；Matsushita等[75]从铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）IFO 3445 的细胞膜中得到了 GADH，其三
【参考文献】

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本文编号：2884941