工程真养产碱杆菌产3-羟基丙酸和3-羟基丁酸共聚物的生物合成研究

发布时间：2020-11-17 19:17

　　 聚羟基脂肪酸酯是一种天然生物聚酯,因其具有良好的生物相容性和生物可降解性而在农业、医药、食品以及材料行业有着广泛的应用,聚3-羟基丁酸酯为较早被发现的可降解型生物聚酯,但其在材料学性质上有一定的局限性,如较低的延展性限制了其进一步的应用,在聚3-羟基丁酸酯中加入3-羟基丙酸单体可改善共聚物的材料学性质,但是早期研究中3-羟基丙酸及含3-羟基丙酸单体的共聚物的生物合成都依赖于3-羟基丙酸或其结构相关前体,如丙烯酸、1,3-丙二醇等,这些单体价格昂贵,且会造成环境污染。本研究以真养产碱杆菌H16为出发菌株,该菌株具备以下2个重要特性:一是能够分泌一种胞外酯酶降解周围环境中的油脂使之变为甘油与游离脂肪酸,二是具备二个油脂降解(beta氧化途径)基因簇,有利于游离脂肪酸的转入与降解,使之可利用油脂为唯一碳原进行生长和代谢。本研究通过染色体重组技术将外源的3-羟基丙酸合成途径整合至出发菌株,构建的真养产碱杆菌H16工程菌,可以油脂为唯一碳源,一步合成3-羟基丁酸与3-羟基丙酸的共聚物P(3HB-co-3HP)。本实验同时通过索氏提取以及冰乙醇沉淀相结合的方法从菌体中分离到了纯化产物,并通过核磁分析方法对共聚物的结构以及单体组成进行了分析,通过凝胶色谱确定共聚物的分子量分布。最终的分析结果确定了目标产物P(3HB-co-3HP)的生物合成。本研究在工程菌构建部分的研究工作中将已酰辅酶A羧化酶(accADBC)、丙二酰单酰辅酶A还原酶(mcr)和丙酰辅酶A转移酶(pct)三个关键酶的基因导入目标工作质粒pBBR-pct-mcr-accADBC;并通过结合转移的方法构建了产P(3HB-co-3HP)的工程真养产碱杆菌。该工程菌在5L发酵罐水平以大豆油为碳源发酵得到DCW(细胞干重)为6.08 g/L,共聚物产量3.11 g/L(占细胞干重的51.15%)。共聚物中3-羟基丙酸与3-羟基丁酸单体的比例约为1:2,共聚物分子量达到200000。本研究的发酵优化实验中证明诱导剂阿拉伯糖浓度对工程菌株生产P(3HB-co-3HP)的影响较大。在将其它发酵条件设置为控制变量的条件下,在工程菌摇瓶发酵过程中对数生长期分别加入阿拉伯糖浓度至0.25 mol/L、0.5 mol/L、1 mol/L、2 mol/L,DCW分别为1.52 g/L、2.11 g/L、1.56 g/L和1、21 g/L,P(3HB-co-3HP)分别占细胞干重的57.33%,62.42%,56.76%,52.41%,进一步通过核磁氢谱分析表明,当阿拉伯糖终浓度为0.25 mol/L、0.5 mol/L时,产物为P(3HB-co-3HP),当诱导剂终浓度为1 mol/L、2 mol/L时,产物为P3HB。并测得聚合物的熔点会随着3HP含量的增加而降低。最后本研究还构建了可以高效利用甘油的工程真养产碱杆菌,与未改造的真养产碱杆菌H16相比,表达glpk(甘油激酶)的工程菌大大提高了甘油的利用效率。以甘油为唯一碳源时,工程菌株生长状况明显好于对照菌株,DCW达到=2.16 g/L,PHB产量为细胞干重的68.21%。在此基础上本研究进一步构建质粒pBBR-pct-mcr-accADBC-glpk,探究glpk基因的导入对工程真养产碱杆菌产共聚物P(3HB-co-3HP)影响,此部分研究在质粒构建部分失败。
【学位单位】：青岛科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TQ314.1
【部分图文】：

碱杆菌产 3-羟基丙酸和 3-羟基丁酸共聚物的生据单体单元的组成，聚羟基链烷酸酯（的各种机械性能[12]。酯的生产菌株开发，摇瓶优化，实验室和试验发 的有效微生物生产取决于若干因素，包 细胞干重（CDW）百分比，达到最终细率，底物价格，以及提取和纯化 PHA 的数 PHA 大规模生产用于商业开发。所有以实现高细胞密度增长。然而，连续过程来越多地，使用混合培养物生产 PHA 变

本课题技术路线

青岛科技大学研究生学位论文2 产 P(3HB-co-3HP)工程菌的构建2.1 引言P(3HB-co-3HP)是一种绿色环保的生物材料，然而，在自然界中没有一条已知的代谢途径能够合成该聚合物，本实验我们选择真养产碱杆菌为出发菌株，因为该菌株不仅仅能够利用油脂，而且其染色体上具有合成聚羟基丁酸酯的三个关键基因，分别是 PHA 合酶(PhaC)、3-酮硫裂解酶(PhaA)和乙酰乙酰 CoA 还原酶(PhaB)，在已知的代谢途径中整合 3-羟基丁酸的合成途径，理论上能够生产P(3HB-co-3HP) ， 这 一 部 分 主 要 为 构 建 新 的 代 谢 途 径 ， 合 成 目 标 产 物P(3HB-co-3HP)。
【参考文献】

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1 杨鹏;王琦;咸漠;薛永常;赵广;;聚3-羟基丙酸及其共聚物的生物合成[J];科学通报;2014年22期

本文编号：2887829