Vc混菌发酵中伴生菌解除产酸菌氧化胁迫分子机制研究

发布时间：2020-11-18 01:51

　　 维生素C(Vc)是人体所需的重要水溶性维生素,在食品行业中有着重要的应用价值,其衍生物通常作为抗氧化剂、营养强化剂添加在食品中。维生素C的前体物质2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)可通过微生物发酵的方法获得,这种方法称为二步发酵法,二步发酵法的第二步为混菌发酵,其中包括作为伴生菌的芽孢杆菌和作为产酸菌的普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonicigenium vulgare),两菌的关系为互利共生,但互作机制还不完全明确。已知多种芽孢杆菌均可作为伴生菌,但伴生效果各不相同,对混菌发酵过程伴生菌解除产酸菌氧化胁迫机制的解析,和对不同伴生菌伴生效果不同机制的解析,将有助于探究两菌互作的分子机制,为后续利用生物学手段提升维生素C发酵生产水平奠定坚实的理论基础和方法学基础,同时还可为其他复杂微生物群落的研究提供线索。本文主要研究结果如下:首先对Bacillus endophyticus ST-1和K.vulgare 25B-1单菌及Vc混菌发酵体系的生理特性进行分析,发现B.endophyticus ST-1促进了K.vulgare 25B-1的生长和产酸,同时K.vulgare 25B-1促进了B.endophyticus ST-1芽孢的生成,在发酵后期,发酵体系2-KLG产量逐渐增多,影响了B.endophyticus ST-1的生长;混菌发酵中B.endophyticus ST-1芽孢2,6-吡啶二羧酸(2,6-pyridinedicarboxylic acid,DPA)的含量高于单菌发酵,K.vulgare 25B-1促进了伴生菌芽孢的生成;混菌发酵体系pH值比单菌发酵体系稳定,有利于K.vulgare 25B-1的生长于产酸;混菌发酵体系的氧化还原电位(oxidation-reduction potential,ORP)随着发酵的进行,逐渐降低,并且与2-KLG产量呈现显著负相关。在K.vulgare 25B-1中,获得4个山梨糖脱氢酶基因Kvsdh1、Kvsdh2、Kvsdh3、Kvsdh4和1个山梨酮脱氢酶基因Kvsndh1,这两种酶与2-KLG的生成相关;生物信息学分析显示,这5种蛋白的稳定性较好,为水溶性蛋白,仅Kvsdh1编码蛋白为膜结合蛋白,四个山梨糖脱氢酶的三级结构形态类似,并在Kvsdh1编码蛋白的三级结构中预测到一个钙结合位点和一个吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone,PQQ)结合位点,Kvsdh4编码蛋白的三级结构中也存在一个PQQ结合位点。在混菌发酵中山梨糖脱氢酶基因的表达和酶活逐渐升高在40 h达到最高,随后下降;山梨酮脱氢酶基因的表达在混菌发酵中逐渐升高在66 h达到最高。分析混菌发酵体系对自身氧化胁迫的应激响应,发现混菌发酵中两菌胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平均在18 h大幅度提高,随后逐渐降低;混菌发酵过程中胞外总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)活力、过氧化氢酶活力(catalase,CAT)和总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)均逐渐升高;对两菌抗氧化相关基因表达的分析发现,B.endophyticus ST-1直接清除ROS的酶基因sodA和katE表达量升高,与氧化还原状态相关基因gp和zwf表达升高,K.vulgare25B-1基因grxC、gor、sodB和zwf表达上调;这些结果说明,在混菌发酵中,B.endophyticus ST-1促进了K.vulgare 25B-1的生长和产酸,由于代谢能力增强导致细胞内ROS的积累,引发自身氧化胁迫,并通过某些信号分子将这种信号传递给B.endophyticus ST-1,B.endophyticus ST-1感受到这种信号,调控一系列与抗氧化和调节胞内氧化还原环境相关基因的表达和活性物质的产生。同时K.vulgare 25B-1也促进了B.endophyticus ST-1芽孢的生成,B.endophyticus ST-1芽孢释放母细胞裂解,将胞内液释放到混菌发酵体系中,不仅为K.vulgare 25B-1提供了营养因子,同时也为其提供了良好的氧化还原环境,提高了K.vulgare 25B-1抗氧化能力。对不同混菌发酵体系伴生菌蛋白质组学研究发现,伴生菌B.pumilus A9与B.endophyticus ST-1均可以促进K.vulgare 25B-1的生长,B.pumilus A9的伴生能力更好,Pearson相关系数分析显示两个发酵体系的ORP与2-KLG产量均在0.01水平上显著负相关。Bacillus蛋白组分析显示,在不同伴生菌的混菌发酵体系中,B.pumilus A9比B.endophyticus ST-1糖代谢能力更强,为细胞提供了更多的能量和还原力,为产酸菌提供了更充足的中间代谢产物;在氨基酸生物合成通路中,B.pumilus A9与B.endophyticus ST-1相比促进了甘氨酸和丝氨酸间的相互转化,及苏氨酸的合成,增强了谷氨酸的合成并转化成谷氨酰胺。对Bacillus共有差异蛋白的生物信息学分析显示,B.pumilus A9与K.vulgare 25B-1更能很好的配合,可以同时利用两种途径进行糖代谢,代谢能力较强;在核糖体蛋白通路中,伴生菌B.pumilus A9与温度相关的大亚基核糖体蛋白L6、L22和L23表达的上调;同时发现,B.pumilus A9具有更好的抗氧化能力,对发酵体系氧化还原平衡的调节能力更强。对不同混菌发酵体系产酸菌K.vulgare 25B-1蛋白质组学研究发现,伴生能力强的B.pumilus A9促进了K.vulgare 25B-1的三羧酸循环(TCA)和丙酮酸的代谢,并促进了多种氨基酸的合成代谢,有利于蛋白质的合成,代谢能力的增强。在维生素和辅因子代谢通路中,与维生素B_6代谢相关的酶5'磷酸吡哆胺氧化酶表达的上调,促进了吡哆醇的生成,有利于氨基酸的转氨、脱羧和含硫氨基酸的脱硫。在叶酸一碳单位通路中,相关酶表达的上调,增强了一碳单位的通量,为菌体生长提供必要物质基础。肽聚糖合成相关的酶表达的上调,说明B.pumilus A9更有利于产酸菌肽聚糖的合成和细胞壁的形成。在K.vulgare 25B-1中,只发现了两个与氧化应激相关的蛋白,分别是铁超氧化物歧化酶和受Spx调控的硫氧还蛋白还原酶,这两个蛋白的表达均呈现上调的趋势,可见产酸菌在伴生菌B.pumilus A9的伴生条件下清除活性氧的能力得到了提高,同时调控硫醇平衡的能力也得到了增强,消除了环境中不利于细胞生长因素,促进了产酸菌的生长代谢。本文通过对Bacillus endophyticus ST-1和K.vulgare 25B-1单菌及Vc混菌发酵体系的生理特性、产酸菌产酸酶系基因表达和酶活变化及单菌和混菌发酵体系抗氧化酶活性和基因表达的分析,阐明了伴生菌解除产酸菌氧化胁迫的分子机制;通过对不同发酵体系两菌的蛋白组进行分析,揭示了糖代谢能力和抗氧化能力强的伴生菌,具有更好的伴生效果。
【学位单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TQ920.1
【部分图文】：

论文研究框架

计算 DPA 浓度。与分析发酵体系中菌体的生长曲线菌体 OD（optical density）值的变化可反映菌体的生长状态，hyticus ST-1 和 K. vulgare 25B-1 的 OD650如图 2-1 所示。混菌发酵体浓度高于单菌发酵中 K. vulgare 25B-1 的菌体浓度，在 24 h 25B-1 的菌体浓度为单菌发酵的 6 倍，随后呈下降趋势，这表明vulgare 25B-1 的生长，在混菌发酵中 K. vulgare 25B-1 的生长在 渐进入衰亡期；在 0 h - 35 h 期间，混菌发酵中 B. endophyticu菌发酵，可见 K. vulgare 25B-1 促进了 B. endophyticus ST-1 的endophyticus ST-1 的生长为单菌发酵时的 4.6 倍，而在 35 h 后混us ST-1 的菌体浓度低于单菌发酵，说明其生长受到了抑制。

图 2-2 不同发酵体系中 B. endophyticus ST-1 的 DPA 含量变化（A）DPA 含量标准曲线 （B）不同发酵体系中 B. endophyticus ST-1 的 DPA 含量变化Figure 2-2 Variations in DPA of B. endophyticus ST-1in different fermentation systems(A) The standard curve of DPA concentration (B) Variations in DPA of B. endophyticus ST-1in differentfermentation systems2.3.3 不同发酵体系 pH 变化
【参考文献】

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本文编号：2888193