Dunaliella tertiolecta中乙酰CoA合成酶的基因克

发布时间：2020-12-18 18:22

　　乙酰辅酶A合成酶（ACS）催化乙酰辅酶A的合成,它是油脂代谢和醋酸盐代谢的重要节点之一。据报道,过表达ACS会导致醋酸盐大量被转化为acetyl-CoA,从而支持后续的糖酵解途径、脂肪酸代谢、氨基酸代谢和糖异生作用,并加速细胞生长和物质积累。本研究以特氏杜氏藻（Dunaliella tertiolecta）为主要研究对象,首先利用反转录PCR（RT-PCR）技术得到了长度为1175 bp的DtACS EST序列,该片段经Blast序列比对推断为DtACS基因片段。然后通过cDNA末端快速扩增（RACE）技术获得了长为790 bp的DtACS 5’端序列和长为784 bp的DtACS 3’端序列,经序列拼接得到DtACS的全长cDNA序列为2464 bp,包含长为2184 bp的DtACS ORF序列,编码727个氨基酸。经氨基酸序列同源性分析,发现DtACS与绿藻ACS最为相似（与衣藻Chlamydomonas reinhardtii有68%一致;与团藻Volvox carteri f.nagariensis有70%一致）。生物信息学分析结果显示DtACS分子量为79.72 kDa,等... 

【文章来源】：华南理工大学广东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：83 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
    1.1 微生物油脂及特氏杜氏藻
        1.1.1 微生物油脂
        1.1.2 微藻生物柴油
        1.1.3 杜氏藻属及特氏杜氏藻
    1.2 乙酰CoA合成酶（ACS）及油脂代谢通路
        1.2.1 油脂代谢通路的基因工程研究
        1.2.2 乙酰CoA合成酶（ACS）
        1.2.3 国内外研究现状
    1.3 cDNA末端快速扩增技术
    1.4 本章小结
第二章 特氏杜氏藻ACS基因的克隆及生物信息学分析
    2.1 引言
    2.2 实验材料与仪器
        2.2.1 藻种和培养液
        2.2.2 质粒和菌种
        2.2.3 试剂
        2.2.4 主要仪器设备
        2.2.5 常用试剂的配制
    2.3 实验方法
        2.3.1 特氏藻的培养
        2.3.2 特氏藻总 RNA 的提取与测定
        2.3.3 PCR扩增目的基因
    2.4 生物信息学分析DtACS
        2.4.1 DtACS的物理化学性质分析
        2.4.2 DtACS氨基酸序列相似性搜索和保守结构域预测
        2.4.3 DtACS亚细胞定位分析
        2.4.4 DtACS同源性比对以及系统发育树构建
        2.4.5 DtACS结构预测
    2.5 结果与讨论
        2.5.1 DtACS cDNA克隆
        2.5.2 生物信息学分析DtACS
    2.6 本章小结
第三章 构建原核表达载体pET-32a（+）-DtACS和工程菌pET-32a（+）-DtACS-BL21（DE3）
    3.1 引言
    3.2 实验材料与仪器
    3.3 目的条带的扩增、分离、回收、连接、转化与测序
        3.3.1 扩增目的条带
        3.3.2 回收目的DNA片段
        3.3.3 线性化载体的制备
        3.3.4 纯化酶切产物
        3.3.5 连接
        3.3.6 转化连接产物
        3.3.7 筛选阳性克隆
        3.3.8 双酶切鉴定
        3.3.9 测序与保存
        3.3.10 转化至E.coli BL21 （DE3）感受态细胞
    3.4 结果与讨论
        3.4.1 菌液PCR进行阳性克隆检测
        3.4.2 双酶切鉴定
    3.5 本章小结
第四章 在大肠杆菌中异源表达纯化重组DtACS
    4.1 引言
    4.2 实验材料
    4.3 异源表达纯化重组DtACS
        4.3.1 确定最适表达条件
        4.3.2 SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳流程
        4.3.3 大量表达重组蛋白
        4.3.4 纯化重组蛋白
    4.4 重组DtACS酶活力的测定
        4.4.1 酶活力测定反应体系
        4.4.2 Bradford法测定蛋白浓度
        4.4.3 比酶活计算公式
        4.4.4 DtACS动力学分析以及其最适pH值和温度的测定
    4.5 结果与讨论
        4.5.1 蛋白表达预实验
        4.5.2 重组蛋白纯化
        4.5.3 DtACS酶活测定
    4.6 本章小结
结论与展望
    结论
    创新点
    展望
参考文献
攻读硕士学位期间取得的研究成果
致谢
答辨委员会对论文的评定意见


【参考文献】：
期刊论文
[1]产油微生物的研究及其应用[J]. 易绍金,郑义平.  中外能源. 2006(02)
[2]产油微生物油脂生物合成与代谢调控研究进展[J]. 刘波,孙艳,刘永红,赵宗保.  微生物学报. 2005(01)



本文编号：2924392